比色法測(cè)定大血藤中總黃酮含量及其清除DPPH自由基研究

王偉+鄒金美+黃冰晴+趙曉丹+洪雅珍+張國(guó)廣

摘要：以中藥材大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils]的乙醇提取物為對(duì)象，提出1種基于比色法的大血藤總黃酮測(cè)定方法，同時(shí)考察了提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明，以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品的亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法更適合大血藤提取物中總黃酮含量的測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為510nm，蕓香苷在0～0.5mg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為99.3%，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均理想；抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明大血藤提取物具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

關(guān)鍵詞：大血藤；總黃酮；紫外-可見分光光度法；抗氧化性；自由基

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0356-03

中藥大血藤是木通科植物大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.]的干燥藤莖，具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)止痛等功效，主治腸癰腹痛、熱毒瘡瘍、經(jīng)閉、跌撲腫痛、風(fēng)濕痹病等癥，主要產(chǎn)自湖北省、四川省、江西省、浙江省、江蘇省、福建省等地。大血藤在不同地區(qū)名稱不一，《中藥大辭典》記錄的別名有：血藤、過山龍、紅藤、千年健、血竭、血通、大活血、活血藤等10多種[1]。研究表明，大血藤含有多種化學(xué)成分，包括黃酮類、酚類、有機(jī)酸、木脂素、三萜皂苷、蒽醌類、糖苷類等物質(zhì)，具有抑菌、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、增加冠脈血流量、抗心肌等功效[2-6]。黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝護(hù)肝、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抑菌、抗衰老、提高免疫力等功效。大血藤中黃酮類化合物受到很多研究者的關(guān)注[7-13]。本研究以中藥材大血藤的乙醇提取物為對(duì)象，提出一種基于比色法的大血藤總黃酮測(cè)定方法，同時(shí)考察了提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力，旨在為開發(fā)利用大血藤資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

大血藤藥材購(gòu)于福建省漳州市某中藥店。槲皮素與蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。DPPH購(gòu)于梯希愛（上海）化成公司；無水乙醇、氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、維生素C等藥品均為分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AR124CN電子分析天平（美國(guó)奧豪斯公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；UV-1750紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）；MultiskanGO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；ZWY-2102C全溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）；萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2樣品溶液的制備

用粉碎機(jī)將大血藤藥材充分粉碎，準(zhǔn)確稱取藥材粉末0.5g，置于燒杯中，加入60%乙醇50mL，封口后放入全溫?fù)u床120r/min60℃振蕩浸提24h。浸提結(jié)束后超聲破碎提取30min，超聲破碎程序設(shè)定為超聲15s，間歇15s，超聲頻率40Hz，功率1000W。超聲結(jié)束后抽濾取過濾液，用60%乙醇定容至50mL，得到10g/L樣品溶液。

1.3黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱取蕓香苷、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各5mg，分別置于50mL容量瓶中，加適量無水乙醇將其完全溶解，純水定容，得到0.1mg/mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液。

1.4黃酮3種定量測(cè)定方法

1.4.1直接測(cè)定法分別取大血藤提取物溶液、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，用紫外分光光計(jì)在300～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，60%乙醇作基線處理，記錄吸光度。

1.4.2三氯化鋁法分別取1mL大血藤提取物溶液、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，加入3支10mL具刻度試管中，依次加入1mL0.1mol/LAlCl3溶液及1mLpH值為5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖液，用60%乙醇定容至刻度，在300～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，60%乙醇同樣顯色后作掃描基線，記錄吸光度。

1.4.3亞硝酸鈉-硝酸鋁法分別取1mL大血藤提取物溶液、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，加入3支10mL具刻度試管中，加60%乙醇定容至5mL，加5%NaNO2溶液300μL，靜置6min后加入10%Al（NO3）3溶液300μL，靜置6min后再加入4mL1.0mol/LNaOH溶液，最后用60%乙醇定容至10mL，30℃水浴靜置20min，在300～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，60%乙醇加顯色劑管作掃描基線，記錄吸光度。

1.5亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法考察

根據(jù)以上3種方法的光譜掃描結(jié)果，篩選出合適的標(biāo)準(zhǔn)品為蕓香苷，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法顯色進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5mL至6支10mL具刻度試管中，加60%乙醇稀釋至5mL，按照“1.4.3”節(jié)的方法顯色，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2精密度試驗(yàn)精確移取標(biāo)準(zhǔn)品液1mL，樣品液1mL（5個(gè)平行樣），按亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進(jìn)行操作，測(cè)定510nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)將蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品及樣品按亞硝酸鈉-硝酸鋁法操作，每隔10min于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定1次吸光度，共測(cè)60min，計(jì)算樣品測(cè)定值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.4重現(xiàn)性考察精確稱取大血藤粉末4份，每份0.5g，按照“1.2”節(jié)方法制成大血藤提取液，按亞硝酸鈉-硝酸鋁法進(jìn)行操作，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算4份大血藤提取物的總黃酮濃度，計(jì)算4份樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)用移液管精確移取5mL樣品液置于燒杯中，加入60%乙醇溶液稀釋至20mL，精確吸取1mL稀釋后的樣品液置于3支10mL具刻度試管中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得1mL提取液中黃酮濃度，取平均值。另取4支干凈試管，精密吸取1mL上述已測(cè)定黃酮濃度的樣品液，分別加入1、2、3、4mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液，按亞硝酸鈉-硝酸鋁法操作，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率。endprint

1.6DPPH自由基清除能力測(cè)定

將大血藤樣品母液分別配制成藥材干質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6個(gè)濃度梯度。取96孔酶標(biāo)板，每6個(gè)測(cè)定孔為1組，依次加入不同濃度的大血藤提取物100μL，然后選其中1組分別加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1組分別加入100μL無水乙醇作為對(duì)照組，混勻，室溫下放置30min后，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中517nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度，加入DPPH組測(cè)定值為As，加入無水乙醇組測(cè)定值為At，同時(shí)設(shè)置100μL60%乙醇加100μLDPPH反應(yīng)組，其吸光度作為空白對(duì)照Do，DPPH自由基清除率（I）計(jì)算公式如下。維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1光譜掃描結(jié)果

由圖1可知，蕓香苷在368nm波長(zhǎng)處、槲皮素在336nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，樣品在434nm波長(zhǎng)處有較大吸收峰，在近300nm波長(zhǎng)處吸光度達(dá)到最大，該區(qū)間與標(biāo)準(zhǔn)品沒有很好地重疊，且大血藤提取物肉眼觀察呈現(xiàn)紅色，因此在紫外區(qū)-近紫外區(qū)吸光度較大，且紫外區(qū)測(cè)定易受蒽醌、酚類物質(zhì)的干擾，該方法不適合大血藤黃酮的定量測(cè)定。由圖2可知，AlCl3顯色體系中，槲皮素在430nm波長(zhǎng)處、蕓香苷在414nm波長(zhǎng)處吸光度最大，大血藤樣品在420nm波長(zhǎng)附近并沒有明顯吸收峰，該方法不能用于大血藤黃酮的定量測(cè)定。由圖3可知，在亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色體系中，蕓香苷在510nm波長(zhǎng)處吸光度最大，樣品在502nm波長(zhǎng)處吸光度最大，二者吻合度較高，槲皮素可見光區(qū)未觀察到明顯的吸收峰，所以本研究確定蕓香苷為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法，測(cè)定波長(zhǎng)為510nm進(jìn)行下一步試驗(yàn)。在該顯色方法下，加入NaOH后，溶液中出現(xiàn)肉眼幾乎難以察覺的細(xì)小懸浮物，長(zhǎng)時(shí)間靜置后變成沉淀析出，用濾紙將溶液過濾后進(jìn)行測(cè)定，后續(xù)試驗(yàn)均需將測(cè)定溶液靜置20min后用濾紙過濾后測(cè)定。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性回歸方程為y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，線性范圍為0～0.5g/L。

2.3精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度RSD為2.51%，樣品溶液吸光度RSD為1.58%，精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度RSD為0.26%，樣品溶液吸光度RSD為2.28%，說明在60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性好。

2.5重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

重現(xiàn)性考察結(jié)果表明，4次平行提取大血藤提取物中黃酮含量分別為0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值為0.5785g/L，RSD為2.99%，重現(xiàn)性好。

2.6加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

稀釋后大血藤樣品黃酮平均含量為0.150mg/mL，加標(biāo)回收率在97.7%～101.0%，平均回收率為99.3%（表3），說明該法準(zhǔn)確度高。

2.7大血藤DPPH自由基清除能力

由圖4可知，隨著大血藤提取物濃度和維生素C濃度的增大，DPPH自由基清除率均逐漸升高。

3結(jié)論與討論

大血藤藥材中黃酮種類較為復(fù)雜，有數(shù)十種[10]。目前，不同學(xué)者采用不同的方法對(duì)大血藤藥材中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，有采用HPLC方法測(cè)定的[8]，有采用紫外法即低濃度氯化鋁顯色后在275nm處測(cè)定的[7]，有采用氯化鋁顯色后在420nm處測(cè)定的[9]，有采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色后在510nm處[13]測(cè)定的。本研究結(jié)果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3顯色后在420nm附近并沒有明顯的光吸收峰，直接在紫外光范圍內(nèi)測(cè)定易受大血藤中蒽醌類、酚類化合物干擾，且對(duì)樣品制備條件及機(jī)器性能要求比較高，二者不適合用于大血藤黃酮的比色法定量，因此筆者選擇了亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。筆者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，加入NaOH溶液后，會(huì)形成一些肉眼難以觀察到的細(xì)小懸浮物，將溶液放置8h以上，在試管中能看到明顯的沉淀物（同時(shí)進(jìn)行的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液顯色中未出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象）。曾凡駿等用同樣的方法測(cè)定銀杏葉總黃酮時(shí)也觀察到這種沉淀[14]。本試驗(yàn)將靜置時(shí)間延長(zhǎng)至20min，讓原花色素類物質(zhì)在堿性條件下充分沉淀，取濾紙過濾溶液用于測(cè)定，60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性很好。大血藤黃酮類化合物組成比較復(fù)雜，藥材來源、提取工藝、測(cè)定方法、標(biāo)準(zhǔn)品選擇等諸多因素對(duì)測(cè)定結(jié)果均有較大影響。本研究中基于分光光度計(jì)的亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、線性關(guān)系、加標(biāo)回收率均較高。DPPH在有機(jī)溶劑中是1種較穩(wěn)定的自由基，在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，其結(jié)構(gòu)中1個(gè)氮原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，該孤對(duì)單電子被配對(duì)而導(dǎo)致其顏色變淺，而且這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)呈化學(xué)劑量關(guān)系，因此DPPH被廣泛用于檢測(cè)自由基的清除情況以及評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

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[14]曾凡駿，陳松波，曾里，等.一種改進(jìn)的銀杏黃酮紫外分光光度檢測(cè)方法的研究[J].食品科學(xué)，2003，24（11）：102-104.endprint

1.6DPPH自由基清除能力測(cè)定

將大血藤樣品母液分別配制成藥材干質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6個(gè)濃度梯度。取96孔酶標(biāo)板，每6個(gè)測(cè)定孔為1組，依次加入不同濃度的大血藤提取物100μL，然后選其中1組分別加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1組分別加入100μL無水乙醇作為對(duì)照組，混勻，室溫下放置30min后，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中517nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度，加入DPPH組測(cè)定值為As，加入無水乙醇組測(cè)定值為At，同時(shí)設(shè)置100μL60%乙醇加100μLDPPH反應(yīng)組，其吸光度作為空白對(duì)照Do，DPPH自由基清除率（I）計(jì)算公式如下。維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1光譜掃描結(jié)果

由圖1可知，蕓香苷在368nm波長(zhǎng)處、槲皮素在336nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，樣品在434nm波長(zhǎng)處有較大吸收峰，在近300nm波長(zhǎng)處吸光度達(dá)到最大，該區(qū)間與標(biāo)準(zhǔn)品沒有很好地重疊，且大血藤提取物肉眼觀察呈現(xiàn)紅色，因此在紫外區(qū)-近紫外區(qū)吸光度較大，且紫外區(qū)測(cè)定易受蒽醌、酚類物質(zhì)的干擾，該方法不適合大血藤黃酮的定量測(cè)定。由圖2可知，AlCl3顯色體系中，槲皮素在430nm波長(zhǎng)處、蕓香苷在414nm波長(zhǎng)處吸光度最大，大血藤樣品在420nm波長(zhǎng)附近并沒有明顯吸收峰，該方法不能用于大血藤黃酮的定量測(cè)定。由圖3可知，在亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色體系中，蕓香苷在510nm波長(zhǎng)處吸光度最大，樣品在502nm波長(zhǎng)處吸光度最大，二者吻合度較高，槲皮素可見光區(qū)未觀察到明顯的吸收峰，所以本研究確定蕓香苷為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法，測(cè)定波長(zhǎng)為510nm進(jìn)行下一步試驗(yàn)。在該顯色方法下，加入NaOH后，溶液中出現(xiàn)肉眼幾乎難以察覺的細(xì)小懸浮物，長(zhǎng)時(shí)間靜置后變成沉淀析出，用濾紙將溶液過濾后進(jìn)行測(cè)定，后續(xù)試驗(yàn)均需將測(cè)定溶液靜置20min后用濾紙過濾后測(cè)定。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性回歸方程為y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，線性范圍為0～0.5g/L。

2.3精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度RSD為2.51%，樣品溶液吸光度RSD為1.58%，精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度RSD為0.26%，樣品溶液吸光度RSD為2.28%，說明在60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性好。

2.5重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

重現(xiàn)性考察結(jié)果表明，4次平行提取大血藤提取物中黃酮含量分別為0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值為0.5785g/L，RSD為2.99%，重現(xiàn)性好。

2.6加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

稀釋后大血藤樣品黃酮平均含量為0.150mg/mL，加標(biāo)回收率在97.7%～101.0%，平均回收率為99.3%（表3），說明該法準(zhǔn)確度高。

2.7大血藤DPPH自由基清除能力

由圖4可知，隨著大血藤提取物濃度和維生素C濃度的增大，DPPH自由基清除率均逐漸升高。

3結(jié)論與討論

大血藤藥材中黃酮種類較為復(fù)雜，有數(shù)十種[10]。目前，不同學(xué)者采用不同的方法對(duì)大血藤藥材中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，有采用HPLC方法測(cè)定的[8]，有采用紫外法即低濃度氯化鋁顯色后在275nm處測(cè)定的[7]，有采用氯化鋁顯色后在420nm處測(cè)定的[9]，有采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色后在510nm處[13]測(cè)定的。本研究結(jié)果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3顯色后在420nm附近并沒有明顯的光吸收峰，直接在紫外光范圍內(nèi)測(cè)定易受大血藤中蒽醌類、酚類化合物干擾，且對(duì)樣品制備條件及機(jī)器性能要求比較高，二者不適合用于大血藤黃酮的比色法定量，因此筆者選擇了亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。筆者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，加入NaOH溶液后，會(huì)形成一些肉眼難以觀察到的細(xì)小懸浮物，將溶液放置8h以上，在試管中能看到明顯的沉淀物（同時(shí)進(jìn)行的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液顯色中未出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象）。曾凡駿等用同樣的方法測(cè)定銀杏葉總黃酮時(shí)也觀察到這種沉淀[14]。本試驗(yàn)將靜置時(shí)間延長(zhǎng)至20min，讓原花色素類物質(zhì)在堿性條件下充分沉淀，取濾紙過濾溶液用于測(cè)定，60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性很好。大血藤黃酮類化合物組成比較復(fù)雜，藥材來源、提取工藝、測(cè)定方法、標(biāo)準(zhǔn)品選擇等諸多因素對(duì)測(cè)定結(jié)果均有較大影響。本研究中基于分光光度計(jì)的亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、線性關(guān)系、加標(biāo)回收率均較高。DPPH在有機(jī)溶劑中是1種較穩(wěn)定的自由基，在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，其結(jié)構(gòu)中1個(gè)氮原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，該孤對(duì)單電子被配對(duì)而導(dǎo)致其顏色變淺，而且這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)呈化學(xué)劑量關(guān)系，因此DPPH被廣泛用于檢測(cè)自由基的清除情況以及評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

參考文獻(xiàn)：

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[14]曾凡駿，陳松波，曾里，等.一種改進(jìn)的銀杏黃酮紫外分光光度檢測(cè)方法的研究[J].食品科學(xué)，2003，24（11）：102-104.endprint

1.6DPPH自由基清除能力測(cè)定

將大血藤樣品母液分別配制成藥材干質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6個(gè)濃度梯度。取96孔酶標(biāo)板，每6個(gè)測(cè)定孔為1組，依次加入不同濃度的大血藤提取物100μL，然后選其中1組分別加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1組分別加入100μL無水乙醇作為對(duì)照組，混勻，室溫下放置30min后，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中517nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度，加入DPPH組測(cè)定值為As，加入無水乙醇組測(cè)定值為At，同時(shí)設(shè)置100μL60%乙醇加100μLDPPH反應(yīng)組，其吸光度作為空白對(duì)照Do，DPPH自由基清除率（I）計(jì)算公式如下。維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1光譜掃描結(jié)果

由圖1可知，蕓香苷在368nm波長(zhǎng)處、槲皮素在336nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，樣品在434nm波長(zhǎng)處有較大吸收峰，在近300nm波長(zhǎng)處吸光度達(dá)到最大，該區(qū)間與標(biāo)準(zhǔn)品沒有很好地重疊，且大血藤提取物肉眼觀察呈現(xiàn)紅色，因此在紫外區(qū)-近紫外區(qū)吸光度較大，且紫外區(qū)測(cè)定易受蒽醌、酚類物質(zhì)的干擾，該方法不適合大血藤黃酮的定量測(cè)定。由圖2可知，AlCl3顯色體系中，槲皮素在430nm波長(zhǎng)處、蕓香苷在414nm波長(zhǎng)處吸光度最大，大血藤樣品在420nm波長(zhǎng)附近并沒有明顯吸收峰，該方法不能用于大血藤黃酮的定量測(cè)定。由圖3可知，在亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色體系中，蕓香苷在510nm波長(zhǎng)處吸光度最大，樣品在502nm波長(zhǎng)處吸光度最大，二者吻合度較高，槲皮素可見光區(qū)未觀察到明顯的吸收峰，所以本研究確定蕓香苷為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法，測(cè)定波長(zhǎng)為510nm進(jìn)行下一步試驗(yàn)。在該顯色方法下，加入NaOH后，溶液中出現(xiàn)肉眼幾乎難以察覺的細(xì)小懸浮物，長(zhǎng)時(shí)間靜置后變成沉淀析出，用濾紙將溶液過濾后進(jìn)行測(cè)定，后續(xù)試驗(yàn)均需將測(cè)定溶液靜置20min后用濾紙過濾后測(cè)定。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性回歸方程為y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，線性范圍為0～0.5g/L。

2.3精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度RSD為2.51%，樣品溶液吸光度RSD為1.58%，精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度RSD為0.26%，樣品溶液吸光度RSD為2.28%，說明在60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性好。

2.5重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

重現(xiàn)性考察結(jié)果表明，4次平行提取大血藤提取物中黃酮含量分別為0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值為0.5785g/L，RSD為2.99%，重現(xiàn)性好。

2.6加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

稀釋后大血藤樣品黃酮平均含量為0.150mg/mL，加標(biāo)回收率在97.7%～101.0%，平均回收率為99.3%（表3），說明該法準(zhǔn)確度高。

2.7大血藤DPPH自由基清除能力

由圖4可知，隨著大血藤提取物濃度和維生素C濃度的增大，DPPH自由基清除率均逐漸升高。

3結(jié)論與討論

大血藤藥材中黃酮種類較為復(fù)雜，有數(shù)十種[10]。目前，不同學(xué)者采用不同的方法對(duì)大血藤藥材中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，有采用HPLC方法測(cè)定的[8]，有采用紫外法即低濃度氯化鋁顯色后在275nm處測(cè)定的[7]，有采用氯化鋁顯色后在420nm處測(cè)定的[9]，有采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色后在510nm處[13]測(cè)定的。本研究結(jié)果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3顯色后在420nm附近并沒有明顯的光吸收峰，直接在紫外光范圍內(nèi)測(cè)定易受大血藤中蒽醌類、酚類化合物干擾，且對(duì)樣品制備條件及機(jī)器性能要求比較高，二者不適合用于大血藤黃酮的比色法定量，因此筆者選擇了亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。筆者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，加入NaOH溶液后，會(huì)形成一些肉眼難以觀察到的細(xì)小懸浮物，將溶液放置8h以上，在試管中能看到明顯的沉淀物（同時(shí)進(jìn)行的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液顯色中未出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象）。曾凡駿等用同樣的方法測(cè)定銀杏葉總黃酮時(shí)也觀察到這種沉淀[14]。本試驗(yàn)將靜置時(shí)間延長(zhǎng)至20min，讓原花色素類物質(zhì)在堿性條件下充分沉淀，取濾紙過濾溶液用于測(cè)定，60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性很好。大血藤黃酮類化合物組成比較復(fù)雜，藥材來源、提取工藝、測(cè)定方法、標(biāo)準(zhǔn)品選擇等諸多因素對(duì)測(cè)定結(jié)果均有較大影響。本研究中基于分光光度計(jì)的亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、線性關(guān)系、加標(biāo)回收率均較高。DPPH在有機(jī)溶劑中是1種較穩(wěn)定的自由基，在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，其結(jié)構(gòu)中1個(gè)氮原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，該孤對(duì)單電子被配對(duì)而導(dǎo)致其顏色變淺，而且這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)呈化學(xué)劑量關(guān)系，因此DPPH被廣泛用于檢測(cè)自由基的清除情況以及評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

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[14]曾凡駿，陳松波，曾里，等.一種改進(jìn)的銀杏黃酮紫外分光光度檢測(cè)方法的研究[J].食品科學(xué)，2003，24（11）：102-104.endprint