改良小鼠尾靜脈注射器聯合微量注射泵在Micro-CT 碘海醇增強造影中的應用

王艷杰 阿不來海提 張宏偉 吳向未 馮文磊 張 猛

嚙齒類動物因體積小、實驗重復性和可控性好、且成本低廉而成為科學研究中最為廣泛使用的動物模型［1］。Micro-CT，又稱微型CT 或小動物CT，具有微米級的分辨率。它以較低的輻射劑量和高質量的容積測量影像及定量分析功能，為小動物成像研究提供解決方案，在臨床前生物醫學無創成像方面得到廣泛應用［2，3］。Micro -CT 對一些疾病模型(如腫瘤模型、包蟲病模型等)的研究，很多情況下要動態觀察模型的發生、發展過程，這就需要保證小動物存活。掃描前，先將造影劑經尾靜脈注入小鼠體內，尾靜脈穿刺成功與否很大程度上決定實驗能否取得理想的結果。由于Micro-CT 專業造影劑價格較為昂貴，筆者嘗試使用性價比較高的醫用碘海醇造影劑，如何提高圖像采集成功率及降低小鼠死亡率。在參照有關小鼠尾靜脈穿刺實踐的基礎上，進一步改進穿刺設備及操作技術，運用于小鼠Micro - CT 腹部增強造影中，取得了良好效果。

對象與方法

1.實驗動物及分組:健康昆明(KM)小鼠100 只，雌雄不限，6 ～8 周，體重20 ±2g，由石河子大學動物中心提供，隨機分為5 組，每組20 只。應用5 組設備行尾靜脈穿刺:①常規1ml 注射器及2.5#諾和銳針頭;②常規1ml 注射器及4.5#針頭;③常規輸液器7#針頭;④常規輸液器5#針頭;⑤改良4.5#針頭及輸液連接裝置(圖1)。

圖1 各種型號注射器實物圖

2.材料和器材:skyscan1176 Micro-CT 活體成像系統［美國布魯克(Bruker)公司］;PHD 22/2000 微量精密注射泵(美國Harvard 公司，精度為0.0001μl/h);VMR 小動物麻醉機［美國馬特(Matrx)公司］;異氟烷、普通醫用碘海醇造影劑、常規1ml 注射器及2.5#諾和銳針頭、常規1ml 注射器及4.5#針頭、常規輸液器7#針頭、常規輸液器5#針頭、改良4.5#針頭及輸液連接器、75%乙醇、0.9%氯化鈉溶液(250 毫升/瓶)均由石河子大學醫學院第一附屬醫院提供。

3 改良注射器針頭并高壓滅菌后使用:將諾和銳2.5#針芯熱嫁接到4.5#針頭輸液器的輸液枕上，使輸液器的7#和5#針頭變為4.5#針頭(圖1e)。

4.圖像采集過程:(1)尾靜脈擴張:首先對小鼠尾部行備皮處理，之后將小鼠固定，僅尾部顯露，鼠尾浸泡于50℃左右的溫水中約2min，用酒精棉球擦拭尾部，以擴張尾靜脈［4］。(2)操作方法:小鼠行Micro-CT 掃描前需禁食8h，禁水4h，以減小腹部氣體干擾。使用3.4%異氟烷在麻醉揮發罐中使小鼠麻醉，調節合適的刻度，時刻觀察小鼠生命體征，避免麻醉過度，實驗過程中麻醉維持流量為300ml/min。待麻醉滿意后，實驗者將小鼠固定于Micro-CT 掃描床上，使用膠帶將小鼠四肢和胸部固定，要求松緊度適宜。同時由助手調整小鼠位置，使一側面小鼠尾靜脈朝向正上方。穿刺部位選擇尾部中下1/2 ～2/3 處。左手壓住小鼠尾部遠端，右手持針頭，從選擇的靜脈正上方平行進針，利用可機械化設置泵入時間及劑量的微量注射泵持續注入約0.3ml 造影劑(無此設備可使用其他方式代替)，穿刺成功后用輸液貼牢固地固定在掃描床邊緣。(3)圖像采集:5 組穿刺設備經尾靜脈注入碘海醇造影劑，利用Micro-CT 行增強造影掃描，獲得掃描圖像經系統軟件進行圖像重建，觀察重建圖像能否出現增強期。如圖2 所示。(4)止血:分別行以上5 組操作后，操作者用左手拇指壓住注射針頭，撤離注射器，交由另一人用紗布壓住穿刺部位反折尾部進行止血。(5)記錄:記錄穿刺過程中5 組設備的穿刺成功次數和掃描后小鼠死亡數目。

圖2 注入碘海醇造影劑和不同設備穿刺后采集的圖像

5.統計學方法:應用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，計數資料組間比較選用卡方檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

經過實驗驗證，各種型號的注射器優缺點如下:①使用2.5#諾和銳針頭的注射器，尾靜脈注射成功率高，但不能在行CT 時持續泵入造影劑，另由于針體較短，固定時容易脫出;②常規1ml 注射器及4.5#針頭，穿刺成功率較2.5#針頭低，不能在行CT 時持續泵入造影劑;③常規輸液器7#針頭，穿刺成功率較4.5#針頭低;④常規輸液器5#針頭，穿刺成功率較7#針頭高，但較4.5#較低;⑤改良4.5#針頭及輸液連接裝置，穿刺成功率高，在微量注射泵的配合下，可實現造影劑精準、持續的泵入且無人員暴露于輻射下，目前為最優配置。采用前4 組穿刺時，經尾靜脈注射的造影劑很快便經過腎臟進行代謝，導致增強造影效果不明顯。采用第5 組改良的方式進行小鼠尾靜脈注射可以方便控制造影劑的出入量和速度，提高了穿刺的成功率和效率，同時達到了良好的造影效果。統計結果顯示，各組間尾靜脈穿刺成功率比較，差異有統計學意義(χ2=16.000，P =0.003)，圖像采集成功率比較，差異有統計學意義(χ2=13.429，P=0.009)，小鼠死亡率比較，差異有統計學意義(χ2=11.905，P =0.018)。其中第1 組穿刺成功率最高為95%，圖像采集成功率最低為42.10%，小鼠死亡率為30%;第2組穿刺成功率為80%，圖像采集成功率為43.75%，小鼠死亡率為50%;第3 組穿刺成功率最低為50%，圖像采集成功率為50.00%，小鼠死亡率為45%;第4組穿刺成功率為60%，圖像采集成功率為58.33%，小鼠死亡率為15%;第5 組穿刺成功率為90%，圖像采集成功率最高為94. 44%，小鼠死亡率最低為10%;綜合評價各組穿刺成功率、圖像采集率以及小鼠死亡率:第1 組穿刺成功率最高(95%)，但圖像采集率偏低，小鼠死亡率為30%(6 只);第4 組小鼠死亡率較低為15%(3 只)，但穿刺成功率和圖像采集率也較低;第5 組經改良的穿刺設備，穿刺成功率較高(90%)，同時圖像采集率達最高(94.44%)，小鼠死亡率僅為10%(2 只)，同時可以控制注射速度和劑量，就避免了一次性大劑量注射動物不能耐受的情況，有效控制了小鼠的死亡(圖3)。

討 論

適宜的環境溫度對尾靜脈擴張有一定影響，應保持實驗室內溫度在28℃左右，特別是在新疆維吾爾族自治區，在冬季較寒冷條件下，適宜的溫度能夠使血流通暢，降低穿刺阻力，另外應用熱水浴浸泡法也可以使尾靜脈擴張［5］。在進行穿刺時，可以通過回抽血來判斷穿刺是否成功。使用改良組穿刺設備，穿刺后也較易固定，即使小鼠稍微活動也不會影響穿刺效果，在持針方式上，操作者用左手壓住小鼠尾部遠端向下壓低稍傾斜，右手持針，斜面向上，從選擇的靜脈正上方平行進針，針尖緊貼皮下刺入血管后再進針約5mm，感覺無阻力后，稍回撤針見有回血，再輕推無阻力即可注射。在操作過程中，要避免采用其他不規范手式持針在針頭扎入血管后又換手帶來的針頭位移問題。

圖3 不同穿刺設備的尾靜脈穿刺成功率(%)、小鼠死亡率(%)、圖像采集成功率(%)

一些科研工作者在進行Micro -CT 腹部臟器增強造影實驗中，時常會涉及經小鼠尾靜脈注射造影劑的問題。小鼠在正常生理體位下，尾部血管有4 根明顯可見，即背腹面上各有一根動脈，兩個側面各有一根靜脈，平均直徑小于0.6 ±0.5mm［6］。通常情況下尾靜脈注射有著起效快，血藥濃度高等優勢，但由于小鼠尾靜脈較細，穿刺困難而限制了其使用［7，8］。另一方面，Micro -CT 增強成像使用的專用造影劑Microfil［9］、Aurovist - gold nanoparticle angiographic agent、Fenestra LC/VC 等，注入小鼠體內后可在相應臟器部位停留數小時，能夠滿足單次注射增強掃描，但價格較為昂貴，比普通醫用造影劑要高幾十倍以上［10，11］。小鼠尾靜脈單次注射碘海醇造影劑的劑量一般不宜超過0.4ml，如果大劑量迅速推注，會容易造成小鼠超負載性猝死，特別是注射混懸型或高濃度造影劑時，更容易造成并發血管栓塞性猝死，所以應盡量控制好注射劑量和速度。筆者在實驗中常采用的注射劑量為0.3ml，盡管如此，前4 組方式注射后有部分小鼠出現呼吸急促、窒息和心臟驟停等猝死現象，可能與造影劑進入太快，而導致的造影劑超載性猝死。若劑量過小，達不到造影效果，應盡量使劑量和造影效果均衡。使用正確的注射器規格也很重要，有研究者使用1ml 注射器以及2ml 和2.5ml 注射器也取得了一定的實驗成果［12，13］。筆者也發現1ml 注射器的4.5#針頭在尾靜脈穿刺中有較好的成功率，而在小鼠Micro-CT 增強造影實踐中發現上述方法也存在弊端，如不能持續將造影劑以小劑量緩慢按時間-劑量需要，送入鼠體，會導致圖像采集失敗。因此筆者采用的是改良4.5#針頭及輸液連接裝置，配合微量注射泵，將造影劑持續泵入。

雖然Micro-CT 掃描時輻射劑量較低，但積累到一定程度同樣對實驗人員造成身體損害，碘海醇在小鼠體內代謝快，如果使用人工持續不斷地將0.3ml 的造影劑推入鼠體會導致以下問題:①進入鼠體造影劑劑量不精確;②時間不易掌握;③CT 掃描時，輻射對實驗人員身體損害大。利用微量注射泵，可以程序化設定注射時間以及造影劑注射的速率和劑量，這樣就可以避免實驗人員暴露于輻射源下。

經過改良的設備進行小鼠尾靜脈注射，穿刺成功率、圖像采集率和小鼠死亡率均有優化，與其余組相比差異有統計學意義。這種改良的穿刺方式，使得Micro-CT 掃描的基于碘海醇的腹部增強造影效果得到提升，降低了科研成本，這對于后續進行Micro -CT 增強造影的實驗研究廣泛開展提供非常必要的幫助。

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3 王寶明. Micro-CT 系統幾何校正算法研究及實現［D］.西安:西安電子科技大學碩士論文.2012，3

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5 孫美芳，黃德武. 熱水浴浸泡法在大小鼠尾靜脈注射中的應用［J］.實驗動物科學與管理，1999，16(3):36

6 蘇麗娜，郭劍偉，饒光玲.小鼠尾靜脈注射與斷頭取血實驗技術的改進［J］.大理學院學報，2010，9(6):25 -27

7 余紹蘭，馬躍榮.實驗用小鼠尾靜脈穿刺幾點體會［J］. 瀘州醫學院學報，2007，30(4):330

8 陳育堯，黃雪玲. 小鼠尾靜脈注射法［J］. 毒理學雜志，2008，22(4):311 -312

9 Vanden W，Schwarz J，Horssen P，et al. 3D imaging of vascular networks for biophysical modeling of perfusion distribution within the heart［J］. Journal of Biomechanics 2013，46(2):229 -239

10 David LC，Ashish A，Nicholas K，et al. Photoacoustic tomography of joints aided by an Etanercept - conjugated gold nanoparticle contrast agent—an ex vivo preliminary rat study［J］. Nanotechnology 2008;19(9):1 -6

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12 彭艷，姚吉龍.大鼠尾靜脈注射方法的比較［J］.海南醫學，2012，23(2):112

13 陳育堯，黃雪玲. 大鼠尾靜脈注射法［J］. 南方醫科大學學報，2009，29(6):1312