先天性巨結腸患者SEMA3C/SEMA3D 基因錯義突變對Semaphorin 3 蛋白表達的影響

姜 茜 李 頎 張 震 肖 萍 蘇 琳 苗春越 李 龍

先天性巨結腸(hirschsprung disease，HSCR，OMIM# 142623)又稱腸無神經節細胞癥(congenital aganglionosis)，是導致功能性腸梗阻的最常見的小兒消化道畸形，屬典型腸神經系統(enteric nervous system，ENS)先天發育異常性疾病。主要病理特征是病變腸段肌間神經叢和黏膜下神經叢神經節細胞缺如伴神經纖維增生、腸道神經調節紊亂，以致受累腸段持續異常收縮，近端結腸代償性擴張、增厚，形成巨結腸。現已明確HSCR 是一種神經嵴細胞(neural crest cell，NCC)源性疾病，發病與胚胎期NCC 在腸道內的遷移、增殖、分化、成熟異常有關。根據受累腸段的范圍，本病可分為短段型(最常見，約占全部HSCR 的80%)、長段型(15%)及全結腸型(5%)3 種。HSCR平均發生率1/5000，存在明顯種族差異:亞洲人群最高，為2.8/10000［1］。我國屬高發生率國家。近年來通過連鎖分析、全基因組關聯分析研究、基因敲除以及動物模型研究發現并確定了至少11 個基因攜帶的高外顯率、罕見致病突變(high penetrance，rare mutation)以及低外顯率、常見單核苷酸多態性(low penetrance，common polymorphism)，可以解釋部分表型與基因型之間的關聯［2］。盡管如此，在所有已知易感基因累積發現的突變僅能解釋不足10%的患者的發病原因，高度提示其他致病基因或危險因子的存在［3］。

Semaphorins 家族基因編碼的分子是一類系統發生學上高度保守的分泌型或跨膜糖蛋白，屬較早發現的經典的神經元軸突導向因子(axon guidance cues)。根據結構特征共可分為8 個亞族，其中Semaphorin 3(SEMA3)是唯一表達于脊椎動物的分泌型蛋白，包括7 個亞類分子(SEMA3A ～SEMA3G)，可通過自分泌或旁分泌等方式在局部和遠距離都發揮調控作用［4］。從最初發現時起，Semaphorins 家族分子即因在神經系統的發育過程中發揮重要作用而備受關注，其功能主要包括調節神經元遷移，神經元極性、增殖和分化，樹突棘的密度及其成熟，軸突生長、修剪和突觸成熟等［5～8］。近期Semaphorin 3 家族分子在ENS 發育乃至HSCR 中的作用開始逐漸受到學界關注［9，10］。本研究擬對前期在HSCR 患者篩查、發現的5 個SEMA3C/SEMA3D 基因錯義突變進行細胞功能實驗，以檢測其對Semaphorin 3 蛋白表達的影響作用及各自程度，從而為該基因家族參與疾病發生提供更多證據。

材料與方法

1.細胞系和質粒:HEK293T 細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。N-端AP -tagged 野生型小鼠SEMA3C 和SEMA3D 表達質粒由美國約翰霍普金斯大學Aravinda Chakravarti 教授饋贈。

2.主要試劑和液體配制:細胞轉染試劑Lipofectamine 2000 和質粒大提試劑盒(PureLink?HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit)購自Invitrogen 公司。突變誘導試劑盒(QuikChange?Lightning Site - Directed Mutagenesis Kits)購自Agilent Technologies 公司。AP -SEMA3 融合蛋白定量檢測試劑(2 ×SEAP)組分PNPP、Diethanolamine Substrate Buffer 購自Thermo Fisher Scientific 公司;L-Homoarginine hydrochloride、BSA 購自Sigma 公司。蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Tablets)購自Roche 公司。HEK293T 細胞培養液:添加青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM。2 ×SEAP:1mmol/L MgCl2，

4mol/L Diethanolamine，4.5mg/ml L -Homoarginine hydrochloride，1mg/ml BSA，8.9mg/ml PNPP。lysis buffer:1% Triton，10mmol/L Tris (pH 8.0)。

3. 實驗方法:(1)突變質粒誘導及構建:登陸Agilent QuikChange Primer Design 網站設計引物，按照突變誘導試劑盒說明書的步驟合成突變質粒DNA，進而轉化相應感受態細胞進行質粒擴增和提取。(2)HEK293T 細胞轉染:體外培養處于健康狀態的HEK293T 細胞(傳代20 代以內)，待匯合度接近100%時以1∶4傳代于預先經多聚賴氨酸(0.1mg/ml)包被的10cm 細胞培養皿中，大約24h 后將培養液更換為無抗生素的10% 胎牛血清DMEM。8μg 質粒DNA(已經構建好的5種突變質粒及相應野生型全長cDNA 表達質粒)與12μl Lipofectamine 2000 分別于400μl DMEM 液中室溫放置5min，混合后顛倒混勻，室溫放置20min，簡短、快速離心后將質粒DNA與轉染試劑的混合液加入10cm 細胞培養皿中，超凈臺內水平輕柔混勻，放置于37℃孵箱內繼續培養。轉染后12h，將細胞培養液置換為低血清含量的OPTI -MEM 培養液(Invitrogen公司)并于置換培養液72h 后收集培養皿內含有AP-SEMA3融合蛋白的液體，室溫2000 ×g 離心5min 以去除細胞殘渣，將上清轉移至新的50ml Corning 管中于4℃保存備用。(3)AP-SEMA3 融合蛋白定量檢測:參照Flanagan 等［11］的方法，將含有AP-SEMA3 融合蛋白的培養液上清或總蛋白用lysis buffer 按不同比例稀釋至100μl，與事先加至Corning Costar Cell Culture 板中的100μl 2 ×SEAP 混合，錫箔紙包裹避光轉移至versamax microplate reader，將機器波長讀取值調整至405nm 并將檢測時間總長和間隔分別設定為60s 和15s，放入細胞培養板開始進行檢測。(4)HEK293T 細胞總蛋白提取:向10ml lysis buffer 內加入1 片蛋白酶抑制劑，反復顛倒混勻以助溶解。收集培養液上清之后的HEK293T 細胞用預冷的PBS 清洗1 遍，然后徹底吸凈PBS，加入含蛋白酶抑制劑的lysis buffer，用一次性細胞刮將細胞刮下并轉移至1.5ml Ep 管內。冰上放置30min 后4℃低溫離心機離心，12000r/min，20min，最后將上清轉移至新的Ep 管中保存備用。(5)AP-SEMA3 與FLAGHoxb7 質粒雙轉染:為了除外野生型與各突變型質粒轉染效率不同對融合蛋白表達量差異的可能干擾作用，筆者建立了一組AP-SEMA3 質粒與FLAG-Hoxb7 質粒雙轉染實驗，并用60μg HEK293T 細胞胞質蛋白進行蛋白質免疫印跡分析。

結 果

1.5 個SEMA3C/SEMA3D 基因錯義突變:研究者前期對254 例先天性巨結腸患者的3 個Semaphorin 3家族基因(SEMA3A、SEMA3C、SEMA3D)進行測序篩查，一共發現了12 個錯義突變位點，經過受累氨基酸化學性質分析、序列保守性分析和生物信息學預測，最終決定選取其中的5 個突變進行細胞功能實驗。突變位點的詳細信息見表1。

表1 5 個SEMA3C/SEMA3D基因錯義突變位點詳細信息

2.AP -SEMA3 融合蛋白的檢測:利用融合蛋白N-末端含有的堿性磷酸酶在底物PNPP 存在時可以發生顏色變化的特性，可以對各野生型和突變型質粒轉染后所表達的AP -SEMA3 蛋白在特定波長的吸光值進行檢測以達到蛋白定量的目的。圖1 為同一AP-SEMA3 融合蛋白在不同稀釋比例下(2、4、10、20、50 及200 倍)的顯色結果，可見隨著稀釋比例的增加，顏色逐漸變淺，說明光強度的變化與反應體系中融合蛋白量的多少呈正相關。對上述稀釋倍數的AP-SEMA3C WT(野生型)和AP -SEMA3D WT 蛋白吸光值進行檢測后發現(圖2)，稀釋比例過低時(如2 倍稀釋)可能存在光強度過飽和情況，導致吸光值檢測結果不隨時間的延長而上升，而稀釋比例過高時(如200 倍稀釋)，則光強度太弱而與陰性對照的區別大不。此外，為了除外各組質粒轉染效率不同對目的蛋白表達可能產生的干擾作用，筆者還建立了一組AP-SEMA3 質粒與FLAG -Hoxb7 質粒雙轉染實驗，并對提取的HEK293T 細胞胞質蛋白分別進行FLAG-抗體和actin-抗體蛋白質免疫印跡分析，結果顯示不同質粒之間的轉染效率沒有明顯差異(結果未顯示)。

圖1 不同AP-SEMA3 融合蛋白稀釋比例下的顯色結果

圖2 AP-SEMA3C WT(野生型)和AP-SEMA3D WT融合蛋白在不同稀釋比例下的吸光度檢測結果

3.SEMA3C/SEMA3D 基因錯義突變對Semaphorin 3 蛋白表達的影響:鑒于上述結果，筆者最終決定采用20 倍稀釋比例對轉染后HEK293T 細胞培養液上清及胞質中的AP -SEMA3 融合蛋白進行定量檢測。5 個錯義突變中的4 個都會不同程度地影響相應Semaphorin 3 蛋白的分泌和表達(培養液上清:SEMA3C S329G:0.95 ± 0.07，V337M:0.45 ± 0.02;SEMA3D H424Q:0.62 ± 0.05;SEMA3D V457I:0.87 ±0.04，P615T:1.02 ±0.08，n =5，one - way ANOVA，P ＜0.01;HEK293T 細胞胞質提取物:SEMA3C S329G:1.06 ± 0.15，V337M:0.38 ± 0.04;SEMA3D H424Q:0.65 ± 0.15;SEMA3D V457I:0.60 ±0.12，P615T:0.78 ±0.19，n =3，one - way ANOVA，P ＜0.01 或P ＜0.05)，說明即使是這些基因的點突變也可能會嚴重影響蛋白的表達量，從而妨礙蛋白功能的正常行使，詳見圖3、圖4。

圖3 野生型及突變型質粒轉染HEK293T 細胞培養液上清中的AP-SEMA3 融合蛋白定量檢測結果

圖4 野生型及突變型質粒轉染HEK293T 細胞胞質提取物中的AP-SEMA3 融合蛋白定量檢測結果

討 論

先天性巨結腸是一種與遺傳有關的多基因、多因素參與的復雜疾病，可散發，也可呈家族性遺傳。目前已經鑒定的11 個HSCR 相關易感基因，主要來自于ENS 發育中起主要作用的2 個信號通路(RET、EDNRB)，以及可調控、影響這些基因表達的轉錄因子的編碼基因和其他幾個在神經系統發育中已明確具有重要作用的基因。組成ENS 的神經細胞均來源于NCC，后者在胚胎期從神經軸的兩個不同水平進入腸道，稱為腸神經嵴細胞(enteric neural crest cell，ENCC)，在腸間充質中遷移、增殖、定居和分化，最終聚集成規律排列的神經節并發出突起相互聯系，形成兩個重要的神經叢，完成信號傳遞以及靶細胞的支配。這一發育過程具有嚴格的時間窗，不僅取決于ENCC 的內部特質，也受到腸道微環境中多種外部信號分子(主要是間葉組織細胞表達、分泌的蛋白)的引導和影響，缺一不可［12，13］。

對特定基因敲除小鼠的研究發現，不同發育期胚胎腸道內一些蛋白的表達濃度和位置會顯著影響ENCC 的遷移路徑、聚集程度、空間定位和排列方式，從而可能在病理狀態下導致ENS 功能失常而顯現出與人類HSCR 相似的表型［14］。由此可見，對于先天性巨結腸的病因研究，需要從僅僅關注ENCC 的早期發育和變化過程轉移到腸道微環境對神經網絡的形成以及一些精細環節的調控機制上來，著眼于神經元的定向遷移和成熟，神經元突起的生長方向、誘導/抑制分子，靶細胞識別以及突觸的特異性建立等精細調控過程，為解釋本病的一系列特征性、復雜現象(例如疾病嚴重程度及臨床表現的差異和“非經典遺傳方式”的表象等)拓展研究思路。

近期研究發現，新生兒正常腸段的肌間神經叢神經節細胞、腸道黏膜層和內環、外縱兩層平滑肌內都有SEMA3A 蛋白表達，而HSCR 患者無神經節病變腸段平滑肌層內的SEMA3A 表達量無論是與正常對照相比，還是與患者自身的正常腸段相比都有顯著增加，說明該基因編碼的蛋白產物可能是本病的危險因素之一［15］。選取中國東北地區119 例HSCR 患者和93 例正常對照進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析后發現，患者SEMA3A 基因內的一個SNP risk allele(G allele)基因型頻率明顯高于對照組人群，說明該基因可能顯著增加中國東北方人群的HSCR 患病風險［9］。最近報道的200 例西班牙HSCR 患者SEMA3A 和SEMA3D 基因的突變篩查結果，發現了數個有可能導致蛋白功能缺失的嚴重錯義突變，進一步免疫組化分析證實了其中3 個突變蛋白在患者病變腸段表達量的增加，也支持該類分子參與HSCR 發病的可能性［10］。

本研究在發現HSCR 患者攜帶的SEMA3C/SEMA3D 基因錯義突變的基礎上，利用HEK293T 細胞培養、野生型和突變型質粒轉染以及通過測定吸光值定量檢測融合蛋白表達的方法，證實5 個突變中的4個都會不同程度地影響Semaphorin 3 蛋白的表達(以HEK293T 細胞胞質提取物為檢測對象，代表已合成但是尚未分泌至胞外的融合蛋白)，而且其中3 個突變質粒轉染組相應蛋白的分泌也顯著降低。與之相比，SEMA3C S329G 沒有引起任何Semaphorin 3 蛋白量的變化，提示該突變位點可能不具備病理意義，或者至少不是通過影響蛋白表達而在HSCR 發病中發揮作用。前已述及，胚胎發育過程中腸道微環境的某些分子表達位置和濃度梯度的變化可以通過影響ENCC 的遷移路徑、聚集程度、空間定位和排列方式參與ENS 發育的調控，Semaphorin 3 作為一類經典的神經元軸突導向因子，很可能在自身表達失衡(降低或升高)的情況下干擾ENS 的正常發育;另一方面，已有多個實驗證實HSCR 患者腸組織內確實存在Semaphorin 3 蛋白表達失調的現象，提示該家族分子很可能在功能失常的情況下引發HSCR 缺陷表型。通過構建蛋白質模型發現，本研究中引起蛋白質合成和分泌均減少的3 個突變(SEMA3C V337M;SEMA3D H424Q，V457I)都可能顯著降低蛋白穩定性，從而可能由于突變蛋白降解量增加導致上述變化。至于SEMA3C S329G 是否可能干擾蛋白活性，以及SEMA3D P615T 合成量減少的原因，則需要進一步開展功能實驗予以探究。

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