不同臨床類型乙型病毒性肝炎患者淋巴細胞亞群的差異性分析

梁勁松 鄧 鑫 文 彬 梁娟英

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性問題，人群普遍易感，我國隸屬高流行區(qū)，據(jù)統(tǒng)計我國HBV 感染者約9300 萬人，每年約有35 萬人死于與HBV 感染有關的疾病［1］。目前多數(shù)研究者認可機體細胞免疫功能紊亂，未能及時有效清除病毒是慢性乙型病毒性肝炎發(fā)生、發(fā)展的主要原因［2］。宿主細胞免疫應答對疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起主導作用，其中T、NK 淋巴細胞介導的細胞免疫調(diào)節(jié)尤為重要［3］。但機體的免疫功能差異及疾病所處不同階段，感染HBV 后又會出現(xiàn)迥異的臨床癥狀。因此本研究主要針對不同臨床類型HBV 感染者外周血淋巴細胞亞群的差異性，探討急性或持續(xù)感染HBV 對機體細胞免疫功能的影響，旨在為臨床治療HBV 提供依據(jù)。

材料與方法

1.研究對象:2009 年4 月～2012 年8 月在筆者醫(yī)院和南寧市第四人民醫(yī)院門診或住院的195 例不同臨床類型HBV感染患者。診斷依據(jù)中華醫(yī)學會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，且1 年內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)劑及抗病毒藥治療［4］。其中乙型肝炎病毒攜帶者32 例、慢性乙型肝炎36 例、急性乙型肝炎30 例、乙型肝炎肝硬化33 例、原發(fā)性肝癌(HCC)30 例，健康對照者34 例。各組所入選的HBV 感染患者年齡、性別和肝功能均具有可比性。

2.排除標準:所有入選患者均排除甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎等病毒的重疊感染;排除合并自身免疫性疾病或其他原因(乙醇、血吸蟲、藥物等)引起的肝臟損害;排除最近1 年使用抗病毒藥如干擾素或核苷類似物及免疫調(diào)節(jié)治療者。

3.實驗方法:淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+均采用流式細胞術檢測，具體步驟:取外周靜脈血2 ～3ml，以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，混勻后，各吸100μl全血于4 支不同測定管中:第1 管中加入單抗CD3;第2 管中加入單抗CD4;第3 管加入單抗CD4、CD8;第4 管加入單抗CD16+CD56+，并加入同型對照抗體。各管混勻后置暗室孵育30min，加溶血素0.5ml，15min，然后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)0. 3ml，混勻，置于4℃，24h 內(nèi)分別測定CD4+、CD8+和CD4+/CD8+、CD16+CD56+。流式細胞儀為美國BD 公司FACSC Calibur 型，單克隆抗體及試劑均由美國BD 公司提供。

4.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，正態(tài)分布且方差齊時采用t檢驗;非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換后采用校正t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.不同臨床類型HBV 感染者外周血T 淋巴細胞百分比比較:與健康對照組相比，乙型肝炎病毒攜帶者、急性乙型肝炎患者CD3+、CD4+T 細胞百分比及CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝癌患者CD3+、CD4+T 細胞百分比及CD4+/CD8+比值較健康對照組呈逐步遞減，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，以原發(fā)性肝癌患者下降最為明顯。比較CD8+T 細胞發(fā)現(xiàn)，急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎患者較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);但乙型肝炎肝硬化、肝癌患者CD8+T 細胞則顯著下降，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，詳見表1。

2.不同臨床類型HBV 感染患者外周血NK 細胞百分比比較:乙型肝炎病毒攜帶者、急性乙型肝炎患者NK 細胞計數(shù)較健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);慢性乙型肝炎患者NK 細胞計數(shù)較健康對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);乙型肝炎肝硬化、肝癌患者NK 細胞計數(shù)較正常組下降顯著(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 各組患者外周血淋巴細胞亞群表達水平檢測結果(±s)

表1 各組患者外周血淋巴細胞亞群表達水平檢測結果(±s)

與健康對照組比較，* P ＜0.05

組別 n CD3 +(%) CD4 +(%) CD8 +(%) CD4 + /CD8 + NK(CD16 +CD56 +)(%)36 11.46 ±2.13乙型肝炎攜帶者 32 68.62 ±8.17 42.47 ±7.27 28.72 ±4.81 1.61 ±0.34 11.56 ±2.16急性乙型肝炎 30 69.63 ±9.57 42.36 ±7.39 32.24 ±5.37* 1.31 ±0.38* 12.07 ±2.31慢性乙型肝炎 36 63.39 ±7.97* 34.39 ±6.83* 31.38 ±5.69* 1.08 ±0.25* 15.7 ±3.62*乙型肝炎肝硬化 33 60.72 ±7.09* 29.15 ±6.65* 19.42 ±4.19* 1.17 ±0.24* 8.37 ±2.05*原發(fā)性肝癌 30 55.36 ±6.31* 19.18 ±6.38* 18.83 ±4.03* 0.97 ±0.19* 8.02 ±1.96健康對照組 34 69.47 ±9.34 43.53 ±7.32 26.63 ±4.37 1.62 ±0.*

討 論

人體感染HBV 后可出現(xiàn)不同的臨床轉(zhuǎn)歸，目前大多研究者認為HBV 本身并不直接損傷肝細胞，而是誘導宿主自身的免疫反應，間接損傷肝細胞，也就是機體免疫反應是HBV 感染后肝細胞損害的主要病理機制［5］。細胞免疫反應在病毒感染初期即對感染的轉(zhuǎn)歸和預后產(chǎn)生了影響。而宿主免疫功能主要由淋巴細胞各亞群的數(shù)量和功能維持，當淋巴細胞各亞群比例失衡或功能異常時，機體的免疫功能則發(fā)生紊亂，出現(xiàn)不同程度的臨床轉(zhuǎn)歸。

1.不同臨床類型HBV 感染者外周血T 淋巴細胞群差異性分析:乙型肝炎病毒攜帶者大多數(shù)無癥狀，偶爾出現(xiàn)疲乏或其他非肝病特定的癥狀，其對肝損害的嚴重程度受許多因素影響，其中細胞毒性T 淋巴細胞主要免疫表位的突變起重要作用［6］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒攜帶者CD3+、CD4+T 細胞百分比及CD4+/CD8+比值較健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，說明患者雖感染了HBV，但機體細胞免疫調(diào)節(jié)功能尚未紊亂，可以通過多種途徑抑制或清除體內(nèi)HBV 病毒，因此臨床常見較多乙型肝炎病毒攜帶者肝功能或病毒復制常處于靜止狀態(tài)。研究表明，乙型肝炎病毒侵入人體后，CD8+T 細胞在病毒的清除中發(fā)揮著重要的作用，細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)由CD8+T 細胞活化后生成，是免疫應答的重要效應細胞，可識別特異性抗原，能殺傷外來抗原和自身MHC - Ⅰ(major histoeompatibility complex-Ⅰ)類抗原結合的復合物的靶細胞，因此CD8+T 可作為初步評估機體免疫狀態(tài)的指標，但其功能發(fā)揮常依賴于CD4+T 細胞的存在。急性乙型肝炎患者CD8+T 淋巴細胞比例升高，CD4+T 未見明顯升高，CD4+/CD8+比值下降，說明CD8+T淋巴細胞可以浸潤肝臟，一方面有利于抑制病毒，另一方面又可以破壞正常肝臟細胞。而CD4+/CD8+比值的下降導致機體清除病毒能力減弱，是急性感染慢性化的重要因素，因此急性乙型肝炎如未及時治療，常導致急性肝炎的慢性化［7，8］。

本研究結果表明，慢性乙型肝炎患者CD3+、CD4+T 細胞數(shù)及CD4+/CD8+比值較健康組顯著下降(P ＜0.05)。CD4+T 細胞主要是Th 細胞，協(xié)助B細胞進行分化和產(chǎn)生抗體，CD4+T 細胞數(shù)量的減少及功能的下降不利于病毒的清除，CD4+/CD8+比值下降更表明慢性乙型肝炎患者確實存在免疫功能紊亂，且主要表現(xiàn)為免疫功能不足，免疫力不足則是機體不能清除病原體或HBV 在肝內(nèi)持續(xù)復制的主因。乙型肝炎肝硬化、原發(fā)性肝癌患者CD3+、CD4+、CD8+T 細胞數(shù)及CD4+/CD8+比值均同時下降，說明該類患者抗病毒及其清除病毒能力均顯著降低，CD4+/CD8+比值倒置更表明機體免疫處于崩潰狀態(tài)，因此臨床上該類患者容易并發(fā)嚴重并發(fā)癥。

2.不同臨床類型HBV 感染者NK 細胞差異性分析:NK 細胞能通過產(chǎn)生細胞因子和細胞毒性作用兩種方式暫時控制感染并使感染盡量局限化，以待獲得性免疫反應的形成，與免疫功能紊亂的程度緊密有關。患者外周血NK 細胞的比例一定程度上反映了肝內(nèi)NK 細胞的非特異免疫應答狀況。NK 細胞比例高，提示非特異性細胞免疫反應較為劇烈，既有徹底清除病毒的可能，也有造成免疫損傷較重的危險。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者外周血NK 細胞的百分比明顯高于對照組(P ＜0.05)。其機制可能為:當慢性乙型肝炎患者病毒特異性CD8+T、CD4+T 細胞不足以控制或清除病毒，才征召非特異T 淋巴細胞和自然免疫細胞如NK 細胞入肝，非特異細胞密集浸潤使肝細胞炎性壞死，而炎性病變的持續(xù)存在并不能有效清除病毒，因此慢性乙型肝炎患者外周血NK 細胞的比例增高考慮與上述機制有關［9，10］。但HBV 病毒長期不能清除，機體免疫功能受損，則會導致NK 細胞計數(shù)逐漸下降，越來越多的證據(jù)表明NK 細胞可以通過抑制肝星狀細胞的活化，并能產(chǎn)生γ 干擾素來發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究結果中乙型肝炎肝硬化、原發(fā)性肝癌患者NK 細胞計數(shù)顯著下降，使患者免疫平衡遭嚴重破壞，可進一步加重肝臟的損害，這與乙型肝炎肝衰竭患者外周血NK 細胞計數(shù)減少機制有一定的相通性［11］。

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