復方三黃液對銅綠假單胞菌體外抑菌及抑膜效果實驗觀察＊

郭慶昕陳長賢饒華春周曉蘭鐘黎鵑陳水綿

福建中醫(yī)藥大學附屬泉州市正骨醫(yī)院 1 檢驗科 2 脊柱科 3 制劑室 4 小兒骨科，福建省泉州市 362000

復方三黃液對銅綠假單胞菌體外抑菌及抑膜效果實驗觀察＊

郭慶昕1陳長賢2饒華春1周曉蘭3鐘黎鵑4陳水綿1

福建中醫(yī)藥大學附屬泉州市正骨醫(yī)院 1 檢驗科 2 脊柱科 3 制劑室 4 小兒骨科，福建省泉州市 362000

目的：觀察復方三黃液對銅綠假單胞菌的體外抑菌效果及抑制生物被膜形成的能力。方法：采用肉湯稀釋法，以復方三黃液為抑菌藥，觀察其對骨科感染分離出的48株銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）；采用微量平板法測定復方三黃液對銅綠假單胞菌生物被膜的最小抑膜濃度（SMIC）。結果：48株臨床分離菌中12株MIC為200mgml，31株為100mgml，5株為50mgml；復方三黃液對銅綠假單胞菌生物被膜的SMIC50 1、3d均為25mgml，7d50mgml；SMIC80 1、3、7d均為200mgml。結論：復方三黃液對銅綠假單胞菌體外抑菌效果明顯，并能有效抑制其生物被膜形成。

復方三黃液 銅綠假單胞菌 生物被膜

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是目前公認的醫(yī)院感染的重要致病菌，骨科患者由于開放性損傷、手術時間較長、手術植入物等易感因素的存在，使得銅綠假單胞菌成為骨科患者術后感染的重要病原菌[1，2］，由于該菌特殊的生物學特點，常引起各種難治性、持續(xù)性感染，其中生物被膜（Biofilm，BF）的形成是重要因素，生物被膜將細菌包被在基質(zhì)中，并能從留置體內(nèi)醫(yī)療器材生物膜菌落中不斷脫落，經(jīng)體液循環(huán)引起急性或者慢性感染[2～4］。

天然藥物在抗生物被膜方面具有獨特的優(yōu)勢，中藥制劑復方三黃液便是一劑先輩們長期使用的抗感染中藥。為了解該自制藥對銅綠假單胞菌的體外抑菌活性及抑制生物被膜形成的能力，本文選擇48株來源于骨科術后感染的銅綠假單胞菌研究對象，采用微量平板法測定該藥液對臨床分離銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（MIC）；使用剛果紅平板法從48株臨床分離菌篩選出1株產(chǎn)膜能力強的菌株，應用微量平板法半定量粘附試驗對該藥抑制銅綠假單胞菌的生物被膜形成能力進行評估。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株 48株銅綠假單胞菌，來自于2011年1月－2014年7月我院門診和住院收治的骨科切口感染患者，分離出的細菌按照第3版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行鑒定。銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 實驗藥液

1.2.1 復方三黃液：由我院制劑中心配制，取黃連、黃柏、黃芩等中藥共計180g混合，分兩次各用5倍量蒸餾水煎煮30min，過濾出藥液混合，文火濃縮至180ml，此時藥液濃度相當于原生藥1 000μgml。121℃15min高壓蒸氣滅菌后即為實驗備用藥液，冰箱4℃保存，儲存時間不超過1周[3］。

1.2.2 阿奇霉素：由河南輔仁懷慶堂制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20020530。取0.25g瓶的藥物，加入10ml的滅菌注射用水，制備成25 000μgml的實驗藥液。

1.3 試劑 血平板（鄭州安圖生物工程有限公司），胰蛋白胨大豆肉湯（杭州天和微生物試劑有限公司），剛果紅平板（實驗室自制：剛果紅0.8gL，腦心浸液干粉37gL，蔗糖50gL，瓊脂粉12gL），0.25gL結晶紫染色液（珠海貝索生物技術有限公司）。

1.4 儀器 細胞培養(yǎng)板（海門博揚實驗設備廠）、生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術有限公司）、超潔凈工作臺（濟南鑫貝西生物技術有限公司）、高壓滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）、酶標儀（奧地利sunrise）、光學顯微鏡（Nikon）。

2 實驗方法

2.1 測定復方三黃液對48株銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（MIC） 將待檢菌株分別接種于血瓊脂平板，35℃孵育過夜，取無菌細胞培養(yǎng)板，使用胰蛋白胨大豆肉湯將復方三黃液稀釋為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78mgml，第11號孔為陽性對照，第12號孔為陰性對照。第1～11孔分別加入0.5麥氏濁度的菌液20μl。35℃孵育過夜觀察結果，以能抑制細菌生長的藥物最低濃度作為該藥對該菌的最小抑菌濃度（MIC）。每批實驗同時檢測銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853的抑菌效果。

2.2 生物被膜抑制效果試驗觀察

2.2.1 使用剛果紅平板篩選生物被膜陽性菌株，黑色、干燥并出現(xiàn)結晶的菌落為生物被膜陽性，紅色、光滑的菌落為生物被膜陰性。從臨床分離菌中選擇1株生物被膜形成能力強的菌株作為生物被膜抑制效果試驗研究對象。

2.2.2 復方三黃液用胰蛋白胨大豆肉湯稀釋成400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78mgml；同法將阿奇霉素稀釋成400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μgml。取三套96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加稀釋后的藥液100μl，每濃度重復做4孔，每孔加入20μl的0.5麥氏濁度的菌液。第11列為陽性對照，第12列為陰性對照。35℃培養(yǎng)1、3和7d（每隔2d換次藥）觀察結果。

2.2.3 將孵育完成的培養(yǎng)物輕輕倒去，吸干余液，于每孔加入200μl的結晶紫染液，室溫下染色20min，用PBS緩沖液洗4次，吸干余液。每孔加入150μl 95%的乙醇脫色10min，用酶標儀檢測各孔在570nm波長的吸收值（A570），計算四孔的平均吸光值，平均吸光值最接近陽性對照孔吸光值的50%和80%的實驗孔的藥液濃度即為SMIC50、SMIC80。

3 結果

3.1 復方三黃液對48株銅綠假單胞菌抑菌效果 經(jīng)實驗測定，12株MIC為200mgml，31株MIC為100mgml，5株MIC為50mgml。

3.2 復方三黃液和阿奇霉素對銅綠假單胞菌生物被膜的抑制濃度 見表1。

表1 復方三黃液、阿奇霉素對銅綠假單胞菌的50%和80%抑膜濃度

4 討論

在自然界中，絕大多數(shù)細菌并不是以單個浮游狀態(tài)的形式存在，而是以生物被膜的形式存在。細菌生物被膜是細菌相對于浮游狀態(tài)的一種群體生存形式，由細菌、胞外多糖、藻酸鹽等多種成分組成，可以是單一菌種或者是多菌種混種形成。生物被膜具有屏障作用，故存在于生物被膜中菌體（被膜菌）較浮游狀態(tài)的菌體（浮游菌）對抗生素、消毒劑表現(xiàn)出更強的抗性，可以抵抗宿主免疫防御機制的清除作用，因此常引起難治性慢性細菌感染[4，5］。

天然藥物篩選抗生物被膜的密度感應抑制劑的研究中，發(fā)現(xiàn)天然藥物提取物在體內(nèi)外實驗中均顯示出明顯的抗銅綠假單胞菌密度感應系統(tǒng)的活性，在體外還能提高抗生素（如阿奇霉素、妥布霉素）和中性粒細胞對銅綠假單胞菌生物被膜的殺滅作用[6］。中藥經(jīng)典制劑復方三黃液中富含小檗堿、黃芩苷、黃芩素等有效抗菌成分，有研究表明這些抗菌成分可以抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，并同阿奇霉素、左氧氟沙星等抗生素有協(xié)同抑制作用[7］。本實驗體外抑菌效果觀察中，48株臨床分離菌中12株MIC為200mgml，31株MIC為100mgml，5株MIC為50mgml；同時觀察復方三黃液和阿奇霉素對1株成膜能力強的銅綠假單胞菌的抑膜濃度，SMIC50 1、3d均為25mgml，7d50mgml；SMIC80 1、3、7d均為200mgml，對照組阿奇霉素的抑膜濃度SMIC50 1d為25μgml，3、7d均為50μgml；SMIC80 1、3為50μgml，7d為100μgml。以上研究表明，復方三黃液可抑制細菌在浮游狀態(tài)下的生長繁殖，并且與阿奇霉素類似，可抑制該菌的成膜能力，解除生物被膜的生物屏障作用，有利于抗生素和機體免疫因素的殺菌；并且隨著藥物濃度的增加，對銅綠假單胞菌生物被膜形成的抑制作用逐漸增強。

天然藥物在抗生物被膜方面具有獨特的優(yōu)勢，但其抗膜機制尚不清楚，需要進一步深入研究來闡明其抗菌、抗膜機理，為天然藥物的臨床應用提供理論依據(jù)。

[1]何愛詠，李謀林.骨科感染創(chuàng)面病原菌菌譜分析〔J〕.實用臨床醫(yī)學，2008，9（2）：41－43.

[2]趙建萍，李國雄.骨科感染標本的病原學分析〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（1）：135－136.

[3]黃龍，康紹建.不同滅菌方式對三黃藥材滅菌效果及質(zhì)量影響的考察〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2011，31（5）：51.

[4]武建國.細菌生物膜及其臨床問題〔J〕.臨床檢驗雜志，2003，21（4）：244－246.

[5]周潔，韋莉萍.細菌生物膜的形成及其耐藥性研究進展〔J〕.第一軍醫(yī)大學分校學報，2005，28（2）：194－196.

[6]周學東，施文元.微生物生物膜與感染〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：188.

[7]孔晉亮，劉曉嵐，陳一強，等.黃芩水煎液聯(lián)合左氧氟沙星對銅綠假單胞菌生物被膜的影響〔J〕.天津醫(yī)藥，2008，36（5）：331－333.

R969.4

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1001－7585（2015）19－2677－03

2015－05－05

（編輯雅文）

豐澤區(qū)科教興區(qū)重點資助項目（FZ201107）