重組人干擾素α1b層析工藝中內(nèi)毒素的去除

牛曉霞 曹 艷 吳美英

北京三元基因工程有限公司，北京 102600

重組人干擾素α1b層析工藝中內(nèi)毒素的去除

牛曉霞 曹 艷 吳美英▲

北京三元基因工程有限公司，北京 102600

目的通過檢測評價重組人干擾素α1b各步層析工藝中內(nèi)毒素的去除情況，為工藝驗證提供參考。方法重組人干擾素α1b層析工藝采用DEAE Sepharose FF離子交換層析、單抗Sepharose-4B親和層析和Sephacry-S100凝膠過濾層析。采用鱟試劑法檢測層析各階段產(chǎn)物中的內(nèi)毒素含量，計算內(nèi)毒素去除率。結(jié)果每步層析均有去除內(nèi)毒素的作用，以親和層析去除內(nèi)毒素作用最強。最終所得蛋白的內(nèi)毒素含量降至0.7EU/1mg以下，總?cè)コ蔬_到99.9999%。結(jié)論生產(chǎn)重組人干擾素α1b所用分離純化層析技術(shù)在純化蛋白的同時能有效去除產(chǎn)品中的內(nèi)毒素，所得最終產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量遠低于藥典對注射劑的內(nèi)毒素含量要求。

重組人干擾素α1b；柱層析；內(nèi)毒素；去除

細菌內(nèi)毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的特有結(jié)構(gòu)，其化學成分主要是脂多糖（LPS），只有當細胞死亡溶解或用人工方法破壞菌體細胞后才釋放出來[1-2]，所以叫做內(nèi)毒素，又稱之為熱原。LPS具有極強的熱原性，少量LPS（2ng/kg）經(jīng)脈注射就可以引起發(fā)燒，大劑量的可以引起血液循環(huán)障礙和LPS休克癥[3]。因此，非胃腸道給藥制劑中內(nèi)毒素的去除一直是一項重要的任務。

研究發(fā)現(xiàn)，LPS的一端是親水的特異性多糖區(qū)，另一端是疏水的類脂A區(qū)，結(jié)構(gòu)上類似表面活性劑。自然條件下，內(nèi)毒素一般以聚合體形式存在，在親水環(huán)境中還可以形成雙層脂膜或脂囊。內(nèi)毒素的磷酸集團和二價金屬離子螯合，可進一步穩(wěn)定內(nèi)毒素分子間的聚合，形成更大的內(nèi)毒素復合體，分子量可由幾千到數(shù)千萬不等[4]。正是由于這種性質(zhì)的不均一性，生產(chǎn)者們難以找到一個簡單的或者通用的內(nèi)毒素去除方法。水溶液中去除內(nèi)毒素的方法通常有超濾、活性炭吸附、化學降解和柱層析法等[5-6]，各有優(yōu)缺點，由于內(nèi)毒素來源和工藝的多樣性，在重組蛋白的內(nèi)毒素去除時常采用多個工藝過程的結(jié)合。

重 組 人 干 擾 素α1b（recombination human interferon α1b，IFN-α1b）[7]基因工程蛋白采用大腸埃希菌作為表達系統(tǒng)進行發(fā)酵生產(chǎn)，在純化前必須通過高壓勻漿、超生破碎等方法將工程菌破壁，以釋放蛋白。同時，細胞壁內(nèi)的脂多糖也大量釋放到緩沖液中，達到幾萬到幾十萬EU/mL的內(nèi)毒素，這是IFN-α1b溶液中內(nèi)毒素的主要來源。我們通過離子交換層析、親和柱層析和凝膠過濾層析組合的分離純化方法，使內(nèi)毒素在IFN-α1b純化過程中逐步被去除，最終使內(nèi)毒素含量達到注射劑標準。

1 材料與方法

1.1 材料

細菌內(nèi)毒素工作標準品購自中國食品藥品檢定研究院；鱟試劑及檢查用水購自新北生化工業(yè)有限公司，鱟試劑采用實驗室常規(guī)使用批次，已經(jīng)靈敏度復核；DEAE Sepharose FF、Sepharose-4B和Sephacry-S100凝膠均購自GE公司；IFN-α1b發(fā)酵液及系列中間體由北京三元基因工程有限公司生產(chǎn)。

表1 DEAE Sepharose FF柱層析

表2 單抗親和層析

1.2 方法

1.2.1 DEAE Sepharose FF層析 取IFN-α1b粗提制品，以溶液Ⅰ（25mmmol/L Tris HCl，pH7.5）適當稀釋（標記為DB），上樣至用溶液Ⅰ平衡好的DEAE Sepharose FF層析柱，沖洗后以溶液Ⅱ（0.3mol/L NaCl 25mmmol/L Tris HCl，pH 7.5）洗脫得洗脫液（標記為DA）。記錄上樣體積和收樣體積，分別取樣。連續(xù)試驗5批。

1.2.2 單抗親和層析 將DA以溶液Ⅲ（20mmmol/L PBS，pH 7.0）適當稀釋（標記為MB），上樣至用溶液Ⅲ平衡好的Sepharose-4B單抗親和柱，沖洗后用溶液Ⅳ（0.1mol/L甘氨酸pH2.5）洗脫，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，標記為MA，記錄上樣體積和收樣體積，分別取樣。連續(xù)試驗5批。

1.2.3 Sephacry-S100凝膠過濾層析 將MA上樣于用溶液Ⅴ（25mmmol/L PBS，pH7.0）平衡好的Sephacry-S100凝膠柱，以溶液Ⅴ作為洗脫液洗脫得到洗脫液SA。記錄上樣體積和收樣體積，分別取樣。連續(xù)試驗5批。

1.2.4 干擾試驗 選用TAL 0.25EU/mL，采用2010年版《中國藥典》附錄方法[8]對上述DB、DA、MB、MA及SA，進行干擾試驗。

1.2.5 內(nèi)毒素檢測 選用TAL 0.25EU/mL，采用凝膠半定量試驗法[5]。DB、DA稀釋梯度為1萬、10萬、100萬、1000萬、5000萬，在終點稀釋度附近2倍系列稀釋以確定準確的凝集終點；MB、MA稀釋梯度為100、200、500、1000、2000、4000、8000、16000；SA稀釋梯度為1、5、10、20、40、80、100；每一稀釋度2個平行，以第一個出現(xiàn)陰性結(jié)果的稀釋度作為反應終點。內(nèi)毒素含量（EU/mL）=0.25×反應終點稀釋倍數(shù)，內(nèi)毒素總量（EU）=細菌內(nèi)毒素含量×該溶液體積，內(nèi)毒素去除率（%）=（1-上柱后內(nèi)毒素總量/上柱前內(nèi)毒素總量）×100%。

2 結(jié)果

2.1 干擾試驗

干擾試驗表明：SA無干擾作用，DB、DA、MB和MA在10倍以上稀釋時無干擾作用，由于樣品中含有較多內(nèi)毒素，在實際檢測中稀釋倍數(shù)遠遠大于10倍，所以可用TAL 0.25EU/mL對樣品進行內(nèi)毒素檢查。

2.2 DEAE Sepharose FF層析

取DEAE Sepharose FF層析前后的樣品DB和DA，在規(guī)定條件下與TAL反應，結(jié)果顯示：在連續(xù)5批的試驗中，其內(nèi)毒素去除率分別達到81.50%、66.38%、67.81%、70.14%和73.68%，平均去除率為71.90%（表1）。隨著上樣體積和洗脫液體積比的增大，其內(nèi)毒素去除率增大。

2.3 單抗親和層析

取單抗親和層析前后的樣品MB和MA，在規(guī)定條件下與TAL反應，結(jié)果顯示：連續(xù)5批的試驗中，其內(nèi)毒素去除率分別達到99.93%、99.87%、99.99%、99.98%和99.99%，平均去除率99.95%（表2）。相對于DEAE Sepharose FF層析，其內(nèi)毒素去除效果更高，更穩(wěn)定。

2.4 Sephacry-S100凝膠過濾層析

取Sephacry-S100凝膠過濾層析后的樣品，在規(guī)定條件下與TAL反應，計算其內(nèi)毒素含量與MA相比對，結(jié)果顯示：連續(xù)5批的試驗中，其內(nèi)毒素去除率分別達到99.73%、99.82%、99.72%、99.84%和99.92%，平均去除率為99.81%（表3）。SA中蛋白含量為以2mg/mL計算，其內(nèi)毒素含量達到0.7EU/1mg以下。

表3 Sephacry-S100凝膠過濾層析

DEAE Sepharose FF離子 交換層 析、單 抗Sepharose-4B親和層析和Sephacry-S100凝膠過濾層析，以單抗親和層析內(nèi)毒素去除效果最好，經(jīng)過上述三步純化，總內(nèi)毒素去除率達到99.9999%。

3 討論

對于工藝中內(nèi)毒素的去除，有的采用普通的純化技術(shù)[9-10]，也有的采用專門的內(nèi)毒素去除工藝，如活性炭吸附。LIU等[11]發(fā)展了一種采用Triton X-114從重組蛋白中去除內(nèi)毒素的方法。據(jù)報道，利用這種相分離的方法，對內(nèi)毒素的去除率達到99%以上，蛋白質(zhì)的回收率大于90%，且不影響有效成分的活性。本研究采用普通純化技術(shù)組合法，隨著工藝的推進，目的蛋白純度升高，而內(nèi)毒素逐漸清除減少。

離子交換層析速度快、載量高、濃縮效應好，在早期下游純化中擔當重要角色。一般而言，內(nèi)毒素比蛋白質(zhì)在DEAE介質(zhì)上的結(jié)合強很多，分子量越小的內(nèi)毒素結(jié)合得越強[12]，但在目的蛋白洗脫條件下，仍然有大量內(nèi)毒素被洗脫。即便如此，DEAE仍然有著重要的去除內(nèi)毒素的作用，其內(nèi)毒素去除的量是巨大的，雖然去除率不是最高的，可見在內(nèi)毒素含量特別高的情況下，其內(nèi)毒素去除率并不理想。DEAE去除內(nèi)毒素的效果還跟其濃縮效應有關(guān)，一般來講，洗脫前后濃縮倍數(shù)越大，其內(nèi)毒素去除率越高。

單抗親和層析在內(nèi)毒素去除率上具有上佳表現(xiàn)，是由于單克隆抗體鍵合Sepharose-4B親和介質(zhì)與目標蛋白結(jié)合而不與內(nèi)毒素結(jié)合，從而可以去除內(nèi)毒素。但由于介質(zhì)本身的非特異性吸附作用，使一部分內(nèi)毒素因與介質(zhì)結(jié)合而保留。由此看來，在洗脫前對親和柱進行清洗，可以減少一些非特異性吸附，從而獲得更高的內(nèi)毒素清除率。

Sephacry-S100是一種凝膠過濾介質(zhì)，其利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進行分離的一種方法。常用于去除蛋白藥物內(nèi)的大分子寡聚物和小分子無機鹽，也可以去除一部分內(nèi)毒素。作為層析工藝的最后一步，它起著至關(guān)重要的作用。其內(nèi)毒素去除作用機制大致有兩個，一是因為IFN和內(nèi)毒素分子量在其分離范圍內(nèi)，二是凝膠介質(zhì)本身對內(nèi)毒素有吸附作用。

通過上述幾個層析步驟的組合，不僅獲得了較純的IFN-α1b蛋白，更是去除了其中的內(nèi)毒素。了解這個過程中內(nèi)毒素的變化規(guī)律，對于控制最終產(chǎn)品的質(zhì)量是非常有意義的。

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Removal of endotoxin in the chromatography process of recombinant human interferon α1b

NIU Xiaoxia CAO Yan WU Meiying
Beijing Triprime Genetic Engineering Co.Ltd, Beijing 102600, China

ObjectiveEvaluated the removal of endotoxin in the chromatography process of recombinant human inerferen α1b(rHIFN-α1b)，to provide a reference for the process validation.MethodsWe used chromatography to remove endotoxin during the purification of rHIFN-α1b. Ion exchange chromatography of DEAE Sepharose Fast Flow, affinity chromatography of monoclonal antibody bonding Sepharose-4B and gel filtration of Sephacry-S100 were applied consequently. The endotoxin levels were measured by Limulus Amebocyte Lysate gel-clot assay.ResultsEach step process can remove endotoxin, affinity chromatography has the strongest effect. In the final product, up to 99.9999% endotoxin of rHIFN-α1b was removed and to a concentration of 0.7EU/1mg.ConclusionThe process was effective to purify IFN-α1b and remove exdotoxin simultaneously. The endotoxin level of the final product is much lower than Chinese Pharmacopoeia requirements.

Recombinant human interferon α1b; Endotoxin; Chromatography; Removal

TQ464

B

2095-0616（2015）03-51-03

2014-12-02）

▲通訊作者