降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠腎臟血管緊張素II及腎功能的影響

韓琳 秦建國 高譽珊 王媛媛 張曉宇 郭一 宋林梅 羅燕妮 遲笑怡

降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠腎臟血管緊張素II及腎功能的影響

韓琳 秦建國 高譽珊 王媛媛 張曉宇 郭一 宋林梅 羅燕妮 遲笑怡

目的 觀察降壓通絡方對自發性高血壓腎損害大鼠腎臟血管緊張素II(angiotensin II，AngII)及腎功能的影響，探討該方對高血壓腎損害大鼠腎臟的保護機制。方法 采用16周齡自發性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertension Rat，SHR)為研究對象，將其隨機分為模型組、纈沙坦組、降壓通絡方高、中、低劑量組、并設正常血壓大鼠(Wistar Kyoto，WKY)為空白對照，分別灌胃給藥。于給藥后4周和8周分別測定大鼠尾動脈壓力、血肌酐、尿素氮及腎臟AngII蛋白含量，并進行大鼠腎臟病理組織學檢查。結果 給藥4、8周后，與模型組比較，各治療組大鼠血壓、腎臟AngII含量明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)，但給藥4周各組之間比較無統計學意義，給藥8周纈沙坦及降壓通絡方高、中劑量組均明顯低于低劑量組(P＜0.05);纈沙坦及降壓通絡方能顯著降低模型組大鼠血肌酐、尿素氮(P＜0.01，P＜0.05)，改善腎小動脈及腎小球硬化，促進腎組織結構的恢復。結論 降壓通絡方能降低高血壓腎損傷大鼠腎臟AngII含量，從而有效降低大鼠血壓，改善腎臟病理損害，保護腎功能。

降壓通絡方; 自發性高血壓大鼠; 高血壓病腎損害; 血管緊張素II

高血壓病是世界性常見疾病，近年來，隨著高血壓病早期防治及治療措施改進，使得由高血壓引起的心腦血管并發癥明顯下降，但高血壓引起的終末期腎臟病(End stage renal disease，ESRD)逐年增加，在美國高血壓腎損害造成的ESRD占24%，歐洲占17%［1-2］，數據顯示在中國2011年新增的透析患者中，由高血壓腎損害引起的ESRD也占到9.9%，成為繼原發性腎小球疾病、糖尿病腎病之后造成ESRD的第三大病因。在有關衰老的縱向研究發現，腎功能的損傷與平均血壓和年齡有著密切的關系，二者成為腎功能下降的獨立危險因素［3］。隨著社會的老齡化，高血壓腎損害已經引起人們的重視，對高血壓病腎損害的發病機制和防治措施的研究已逐漸成為腎臟病學界的熱點。現有的藥物治療措施雖然能部分的緩解癥狀，但不能影響高血壓腎損害至終末期腎衰的進程，中醫藥對高血壓腎損害的治療顯示了臨床優勢，但作用機制尚不清楚。本文采用自發性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)為研究對象，觀察在高血壓腎損害進程中降壓通絡方對損傷大鼠腎臟血管緊張素II(angiotensin II，AngII)及血壓、腎功能的影響，探討該方對高血壓腎損害大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級16周齡自發性高血壓大鼠(SHR)［4］72只，雄性，體重(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2002-0003。

1.2 藥物與試劑

降壓通絡方由草決明15 g、黃芩15 g、菊花15 g、珍珠母30 g、丹參25 g、紅花10 g組成，將上述中藥水煮醇制取，制成水煎劑，分裝滅菌備用。纈沙坦(由諾華制藥有限公司提供)，血肌酐、尿素氮、以及AngII放免試劑盒由中生北控生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要儀器

大鼠尾動脈血壓測量儀(北京軟隆生物技術有限公司);AE160型電子分析天平(瑞士Mettler公司);全自動石蠟切片機(英國Shandon);Eclipse 50i型顯微鏡(日本Nikon);紫外分光光度計UV-2000(尤尼柯上海儀器有限公司)。

1.4 動物分組與給藥

實驗過程中大鼠自由進食和飲水，分別置于代謝籠里取尿，檢測尿蛋白和尿紅細胞，結果均為陰性用于實驗。將16周齡SHR大鼠隨機分為模型組、降壓通脈方高、中、低劑量組、纈沙坦組、并以同齡Wistar-Kyoto(WKY)大鼠為正常對照組，每組14只。降壓通絡方各組根據成人日用藥量，按動物系數折算，大鼠的有效劑量為14.2 g/kg.d，以此做為中劑量，3倍遞增設置高劑量42.6 g/kg.d，3倍遞減設置低劑量4.73 g/kg.d;陽性藥物對照組給予纈沙坦10 mg/kg.d，灌胃連續4周、8周;模型組及正常對照組給予等量的生理鹽水。

1.5 大鼠血壓的測定

所有大鼠于給藥前、給藥4周后、給藥8周后用尾動脈血壓測量儀測定各組大鼠尾動脈血壓，記錄大鼠清醒狀態下的收縮壓，每只大鼠每回測三次，取其均值作為該樣本的收縮壓。

1.6 大鼠腎組織病理形態學檢查

于給藥后4周、8周末每組各取7只大鼠，10%水合氯醛按0.4 mL/100 g體重腹腔麻醉，腹主動脈取血后處死大鼠，切取大鼠腎臟，留取部分新鮮腎組織用于放射免疫，部分腎組織按冠狀位縱行剖開，置于4%多聚甲醛，石蠟包埋，切3μm切片，行HE染色，光鏡下觀察腎臟血管、腎小球及腎小管間質形態學改變。

1.7 大鼠血肌酐、尿素氮的測定

于給藥4周、8周末每組各取7只大鼠，麻醉后腹主動脈取血2 mL，4℃，3000 r/min離心10分鐘，分離血清，于EP管中保存。采用苦味酸法、二乙酰肟法分別測定血肌酐、尿素氮(按試劑盒說明書操作)。

1.8 大鼠腎臟AngII蛋白含量的測定

于給藥4周、8周末隨機各取7只大鼠殺檢，取新鮮腎組織，吸取血跡，稱重，快速放入生理鹽水1 mL輕輕研磨，然后再100℃水浴中煮沸10分鐘，再次研磨制成勻漿，4℃，3000 r/min離心15分鐘，取上清-20℃保存，用放免試劑盒測定腎組織中的AngII含量(按說明書操作)。同時測定上清液中的蛋白含量予以校正。

表1 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠血壓的影響(±s，n=7)

表1 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠血壓的影響(±s，n=7)

注:與正常對照組相比aP＜0.01;與模型組相比bP＜0.05，cP＜0.01;與纈沙坦組相比dP＜0.05;與高劑量組相比eP＜0.05;與中劑量組相比fP ＜0.05

組別 給藥前(mmHg) 給藥4周(mmHg) 給藥8周(mmHg)正常對照組132.57±11.86 129.29±9.96 114.43±8.77模型組 190.00±12.71a 202.43±10.74a 190.71±5.35a纈沙坦組 181.71±7.69a 188.43±4.35ac 169.43±4.61ac降壓通絡高劑組 186.57±4.83a 188.57±0.6.71ac 170.29±4.89ac降壓通絡中劑組 181.86±14.87a 190.29±11.21ab 171.29±4.72ac降壓通絡低劑組 191.00±12.81a 190.71±8.32ab 177.29±3.04acdef

1.9 統計學處理

數據資料以均數±標準差(±s)表示，采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計學分析，多組均數比較采用方差分析，組間差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間多重比較采用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗。以 P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓的變化

SHR大鼠是基因敲除的自發性高血壓大鼠，大鼠給藥前血壓測量結果顯示模型及各治療組較正常對照組Wistar大鼠血壓明顯增高(P＜0.01)，模型及各治療組之間無顯著性差異，證明其造模有效。給藥4周后及8周后各治療組大鼠血壓與模型組比較顯著降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，給藥4 周時各治療組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。給藥8周后，纈沙坦組、降壓通絡方高、中劑量組均明顯低于降壓通絡方低劑量組，其中纈沙坦組低于高劑量組，高劑量組低于中劑量組，但兩組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。結果見表1。

2.2 大鼠腎臟組織病理形態學變化

大鼠腎組織HE染色結果顯示:正常WKY大鼠腎組織切片未見明顯異常，上皮細胞排列整齊，模型組大鼠可見入球小動脈玻璃樣變性，小葉間動脈及弓狀動脈肌的內膜增厚，腎小球缺血性萎縮，腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，上皮細胞水腫、脫落壞死，管腔萎縮消失，管腔中偶見漏出的紅細胞，間質纖維組織增生。各治療組腎臟損傷情況較模型組明顯改善。結果見圖1、圖2。

圖1 給藥4周后高血壓腎損害大鼠腎臟病理形態的變化(HE染色×200)

圖2 給藥8周后高血壓腎損害大鼠腎臟病理形態的變化(HE染色×200)

2.3 各組大鼠腎功能的變化

大鼠血肌酐結果顯示:模型及各治療組較正常Wistar大鼠血肌酐明顯升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，給藥4周后除降壓通絡低劑量組外，各治療組與模型組比較血肌酐均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);其中降壓通絡方高、中低劑量組低于纈沙坦組，但無顯著性差異(P＞0.05);給藥8周后各治療組較模型組血肌酐明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，其中纈沙坦組、降壓通絡高劑量組明顯低于低劑量組(P＜0.05)。結果見表 2。

表2 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠血肌酐的影響(±s，n=7)

表2 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠血肌酐的影響(±s，n=7)

注:與正常組相比aP ＜0.05，bP ＜0.01;與模型組相比cP ＜0.05，dP ＜0.01;與纈沙坦組相比eP ＜0.05;與高劑量組相比fP ＜0.05，gP ＜0.01

組別 給藥4周Scr(μmol/L)給藥8周Scr(μmol/L)正常對照組65.84±5.41 62.88±2.12模型組 75.79±3.19b 79.09±4.76b纈沙坦組 71.31±1.72bc 71.51±2.33bd降壓通絡高劑組 69.97±1.65ad 70.38±2.23bd降壓通絡中劑組 71.08±1.89bd 73.02±1.92bd降壓通絡低劑組 73.35±2.80bf 75.24±3.80bceg

大鼠尿素氮結果顯示:模型及各治療組較正常對照組Wistar大鼠尿素氮明顯升高(P＜0.01)，給藥4周后除降壓通絡低劑量組外，各治療組與模型組比較均明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05);其中降壓通絡方高、中低劑量組低于纈沙坦組，但兩組之間比較無顯著性差異(P＞0.05);給藥8周后除降壓通絡低劑量組外，各治療組較模型組均明顯降低(P＜0.01)，降壓通絡方高劑量組明顯低于纈沙坦組及降壓通絡方中、低劑量組(P ＜0.01，P ＜0.05)。結果見表3。

2.4 各組大鼠腎臟AngII的含量的變化

模型及各治療組較正常Wistar大鼠腎臟AngII含量明顯升高(P＜0.01)，給藥4周后纈沙坦及降壓通絡方各組較模型組AngII含量明顯降低(P＜0.01，P ＜ 0.05)，但各組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。給藥8周后各治療組AngII含量較模型組明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，與纈沙坦組比較，降壓通絡方高劑量組略低于纈沙坦組，但無統計學意義(P＜0.05)，降壓通絡方中劑量、低劑量組AngII含量均高于纈沙坦組，但僅與低劑量比較有統計學意義(P＜0.01)，降壓通絡方高、中、低劑量各組之間比較均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，說明隨著給藥時間的延長，降壓通絡方呈劑量依賴性的降低高血壓腎損傷大鼠腎臟AngII含量。結果見表4。

表3 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠尿素氮的影響(±s，n=7)

表3 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠尿素氮的影響(±s，n=7)

注:與正常組比較aP ＜0.01;與模型組相比bP ＜0.05，cP ＜0.01;與纈沙坦組相比dP ＜0.05;與高劑量組相比eP ＜0.05，fP ＜0.01

組別 給藥4周BUN(mmol/L)給藥8周BUN(mmol/L)正常對照組5.22±0.47 5.78±0.75模型組 7.83±0.47a 8.03±0.38a纈沙坦組 7.26±0.42ab 7.12±0.39ac降壓通絡高劑組 6.9±0.54ac 6.55±0.5acd降壓通絡中劑組 7.19±0.22ac 7.37±0.62abf降壓通絡低劑組 7.5±0.45ae 7.62±0.31af

表4 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠腎臟AngII含量的影響(±s，n=7)

表4 降壓通絡方對高血壓腎損害大鼠腎臟AngII含量的影響(±s，n=7)

注:與正常對照組相比aP ＜0.01;與模型組相比bP ＜0.05，cP ＜0.01;與纈沙坦組相比dP ＜0.01;與高劑量組相比eP ＜0.05，fP ＜0.01;與中劑量組相比gP＜0.05

組別 給藥4周(pg/g) 給藥8周(pg/g)正常對照組5.52±0.84 5.37±0.91模型組 8.02±0.32a 9.01±0.64a纈沙坦組 7.07±0.64ac 7.07±0.42ac降壓通絡高劑組 6.65±0.57ac 6.85±0.65ac降壓通絡中劑組 6.79±0.76ac 7.58±0.30ace降壓通絡低劑組 7.12±0.34ab 8.29±0.80abdfg

3 討論

腎臟既是血壓調節的重要器官，同時又是高血壓損害的靶器官之一。高血壓腎損害是原發性高血壓常見而嚴重的慢性并發癥之一，是終末期腎病的獨立危險因素［5］。高血壓腎損害的典型病理表現為腎小動脈的肌內膜肥厚和(或)細小動脈的玻璃樣變，進而導致腎小球及腎小管的缺血性改變。另有一部分腎單位由于高灌注、高濾過和高跨膜壓，引起腎小球肥大以及繼發性局灶節段性腎小球硬化，后期表現為腎小球廢棄性或固化性硬化，以及腎小管萎縮及間質纖維化［6］。高血壓腎損害的發病機制十分復雜，Ang II在其發病機制機制中起著重要的作用［7-9］，Ang II是腎素血管緊張素系統(reninangiotensinsystem，RAS)的主要活性成分，它不僅是一種強有力的血管活性肽，可收縮腎小球入球和出球小動脈，引起腎小球毛細血管靜水壓升高，而且是一種生長因子，可刺激系膜細胞內DNA和蛋白質合成，導致系膜細胞增殖和肥大［10］。而目前對與高血壓的治療應用最廣泛的為血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blockers，ARBs)和血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)類藥物，ACEI和ARBs對改善腎臟血流動力學有重要的作用，但是目前仍然有50%的患者臨床療效不明顯，而且ACEI藥物在腎功能損害到一定程度(血清肌酐＞3mg/dl)時，應用受到限制，因此，進一步探索新的治療方法和有效藥物，將有利于延緩高血壓腎損害向終末期腎衰的發展進程。

中醫藥對高血壓腎損害的治療顯示了良好的臨床效果［11-12］，但其取效機制有待于系統深入的研究。本課題組認為高血壓腎損害的病機關鍵在于“肝陽上亢，腎絡瘀阻”［13］，以“平肝通絡”的治法祛除損害因素，暢通氣血滲灌，以降壓通絡方治療該病，該方由著名老中醫郭士魁的降壓通脈方名方發展而來，對心血管疾病療效顯著［14］，本課題組對該方進行化裁用于高血壓腎損害的治療，獲得了很好的臨床效果。為進一步探討該方的取效機制，本課題組采用16周齡的自發性高血壓大鼠為模型，以纈沙坦為陽性對照藥，觀察了降壓通絡方各劑量組對高血壓腎損害大鼠腎臟AngII蛋白含量、尾動脈壓力、腎功能及腎臟病理形態的影響。實驗結果表明模型組大鼠血壓隨著病程的進展持續升高，降壓通絡方各劑量組在兩個時間點對降低大鼠血壓均顯示了明顯的效果，而且在兩個時間點，治療組大鼠腎臟AngII蛋白含量較模型組明顯降低，隨著用藥時間的延長，給藥8周末時課題組發現降壓通絡方呈劑量依賴性的降低大鼠腎臟AngII的蛋白含量，與此同時HE染色顯示降壓通絡方各組大鼠腎組織的病理變化較模型組明顯減輕，腎小球入球動脈及腎小動脈管壁增厚程度減輕，腎小球缺血改善，腎間質纖維化減輕。說明該方可能通過降低腎臟局部縮血管活性物質AngII，起到了降低血壓，改善腎小球缺血，改善腎臟病理結構的作用。通過腎功能的檢測本課題組亦發現降壓通絡方能夠顯著降低血肌酐、尿素氮的含量，而且隨著用藥時間的延長，降壓通絡方的高劑量組比纈沙坦組尿素氮的含量更低，顯示了該方對于改善腎小球缺血，恢復腎臟的功能具有良好效果，但其生物學機制有待于進一步深入研究。

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Effects of Jiangya Tongluo Formula on the kidney and renal function in hypertension nephrosclerosis rats

HAN Lin，QIN Jian-guo，GAO Yu-shan，et al.School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100029，China

QIN Jian-guo，E-mail:qintdtg@163.com

Objectiveo observe the effects of Jiangya Tongluo Formula on the content of AngII in kidney and the renal function in the model of hypertension nephrosclerosis.MethodsSixteen-week-old Spontaneously Hypertension rats were used as research subjects and then the rats were randomly divided into 5 groups:a model group，a Valsartan group，3 Jiangya Tongluo groups and Wistar Kyoto rats were used as control group.All the rats were gavaged respectively.After 4 weeks and 8 weeks，the tail arterial pressure of the rats，Serum creatinine，Urea nitrogen and the dose of AngII in kidney were detected，At the same time，the histopathologic change in kidney tissue was also detected.ResultsAfter 4 weeks and 8 weeks gavage，compared to model group.The tail arterial pressure and the level of Ang II in kidney was decreased in Jiangya Tongluo groups and Valsartan group(P ＜0.01，P ＜0.05).But after 4 weeks gavage，there was no significant difference in therapeutic groups.After 8 weeks gavage，the date in Valsartan and Jiangya Tongluo high and medium dose groups were lower significantly than that of low dose group(P＜0.05).Valsartan and Jiangyatongluo degraded the concentration of SCr，BUN in blood-serum significantly(P ＜0.01，P ＜0.05)，improved the renal arteries and glomerular sclerosis，promoted the recovery of kidney tissue.ConclusionJiangya Tongluo Formula could reduce the level of Ang II in kidney ，decrease blood pressure，ameliorate renal pathologicallesion and protect renal function.

Jiangya Tongluo Formula;Spontaneously hypertension rat;Hypertension nephrosclerosis;Angiotensin II

國家自然科學基金(811734071)，北京中醫藥大學自主選題項目(2332012JYBZZ-JS004);北京市薪火傳承郭士魁研究室項目(2011-SZ-A-27);北京中醫藥管理局雙百工程金章安教授傳承項目

100029北京中醫藥大學基礎醫學院解剖教研室［韓琳、高譽珊、王媛媛、宋林梅(碩士研究生)］;北京中醫藥大學東方醫院腎內科［秦建國、張曉宇(碩士研究生)、郭一(碩士研究生)、羅燕妮(碩士研究生)、遲笑怡(碩士研究生)］

韓琳(1970-)，女，博士，副教授。研究方向:腎臟疾病的臨床與基礎研究。E-mail:hanlinxf89@sohu.com

秦建國(1971-)，博士，副主任醫師，碩士研究生導師。研究方向:腎臟疾病的臨床與基礎研究。E-mail:qintdtg@163.com

R544.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.01.010

2014-05-29)

(本文編輯:蒲曉田)