促紅細胞生成素在窒息大鼠復蘇后心功能不全的表達及干預作用的研究

黃佳 周厚榮

（1.貴陽醫學院，貴州 貴陽550004；2.貴州省人民醫院急診科，貴州 貴陽550002）

心肺復蘇本質是全身缺血再灌注損傷，其中復蘇后心功能不全是復蘇后引起心跳停止的主要原因。隨著近年來對促紅細胞生成素（erythropoietin EPO）研究的不斷深入，相關實驗證實EPO對心肌缺血再灌注損傷（mypcardial ischemia and rupufusion，MI／R）具有明顯的保護作用［1－2］，包括心肌缺血前、缺血時及再灌注時使用單一劑量的EPO均能產生顯著的心肌保護作用［3］。目前未見心肺復蘇后EPO表達的報告，EPO對復蘇后心功能不全的干預作用亦罕見報道。本實驗旨在通過建立窒息大鼠心肺復蘇模型，探討心肺復蘇術后各時間點EPO的表達情況及外源性補充EPO對復蘇后心功能不全的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 由中醫學院實驗動物中心提供［許可證號SCXK（渝）2012-0005］健康成年SD大鼠72只。術前晚上禁食，可自由飲水，維持體溫正常。隨機分為假手術組（S）、常規復蘇組（C）、促紅素組（EPO）三組，每組分為0h、2h、4h、6h四個亞組，每組6只。0h為術前組，2h、4h、6h為術后組。S組僅進行麻醉、氣管切開、血管穿刺，不進行窒息、機械通氣以及心肺復蘇。C組及EPO組行動靜脈穿刺、氣管切開、窒息、有創機械通氣及心肺復蘇。S組及C組于各時間終點采血查EPO水平。EPO組因外源性補充EPO故不查血清EPO水平。

1.2 動物模型制備 根據Hemdrickx等［4］的方法創建心肺復蘇模型。具體如下：將S組、C組及EPO組的SD大鼠稱重后給予水合氯醛按350mg／kg（3.5mg／100g）腹腔內給藥，麻醉滿意后將大鼠仰臥于手術臺上，作左頸動脈置管，接ASB－240S生物信號采集分析系統（成都傲生科技公司生產）測量 HR、MAP、LVSP、LVEDP、±LVdP／dtmax值。行氣管切開，接ALC-V9動物呼吸機（上海奧爾特生物科技有限公司生產），機械通氣參數：通氣頻率80次／min，通氣量為6mL／min，I∶E為1∶2，吸氧濃度為100%。以上操作完畢后將SD大鼠置室溫下穩定10min，C組及EPO組夾閉氣管插管，停機械通氣，CA持續240s后立即給予心肺復蘇。打開已夾閉氣管，給予有創機械通氣，相關參數同前。心肺復蘇標準：胸外按壓頻率160次／min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1／3，按壓所產生的平均動脈壓達35mmHg以上，并快速給予腎上腺素（福州海王福藥制藥有限公司，規格：1mg／mL）0.02mg／kg（給藥容積1mL／kg），3min重復給予腎上腺素靜脈給藥，經積極心肺復蘇15min未成功者放棄復蘇。C組給予腎上腺素0.02mg／kg（給藥容積1mL／kg＋NS 1mL／kg），EPO組于復蘇前給予rhEPO（山東阿華生物藥業有限責任公司，規格：4 000IU／kg）5 000U／kg［5］（給藥容積1mL／kg）＋腎上腺素0.02mg／kg（給藥容積1mL／kg）。實驗各時間終點，取血6mL，離心，取上層血清，處死動物。

1.3 心臟停搏（CA）的標準 （1）心電圖提示心電靜止，心室顫動［6］；（2）心電機械分離；（3）心尖區心臟搏動消失；（4）動物皮膚、黏膜明顯發紺；（5）平均動脈壓低于20mmHg（1mmHg＝0.133kPa）。

1.4 自主循環恢復（ROSC）判斷的指標 （1）心電圖出現正常的QRS波群（與夾閉氣管前的心電圖表現相近）；（2）可觸摸到明顯的心尖搏動，收縮壓不低于60mmHg；（3）動物皮膚、黏膜發紺明顯減輕。

1.5 EPO的檢測 血清EPO采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定，試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。試劑在使用前先在室溫20～25℃放置15～20min，嚴格按照說明書操作步驟進行操作，避免誤差，設立復孔，取平均值。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。如方差齊，采用成組設計資料的t檢驗，兩兩比較用SNK法；如方差不齊，則采用隨機區組設計的秩和檢驗（Wilcoxon檢驗）；相關性分析采用雙變量相關分析，相關系數選用Pearson做雙尾檢驗，P＜0.01示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組實驗大鼠之間基本情況比較 各組實驗大鼠之間體質量、水合氯醛使用量、腎上腺素使用量、窒息時間、復蘇（CPR）時間、自主循環恢復（ROSC）時間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1、表2。

表1 各組實驗大鼠基本情況比較（±s，n＝18）

表1 各組實驗大鼠基本情況比較（±s，n＝18）

注：組間數據比較差異均無統計學意義（P＞0.05）

組別 體質量（g） 水合氯醛使用量（mg）S組325.50±5.29 115.21±2.48 C組 331.16±4.16 116.44±3.74 EPO組328.41±4.93 114.30±3.18

表2 心肺復蘇組實驗大鼠基本情況比較（±s，n＝18）

表2 心肺復蘇組實驗大鼠基本情況比較（±s，n＝18）

注：組間數據比較差異均無統計學意義（P＞0.05）

組別 腎上腺素使用量（μg） CPR時間（s） ROSC時間（s） 窒息時間（s）C組 6.12±0.41 204.50±5.88 625.36±5.63 209.81±4.64 EPO組 6.20±0.22 199.33±4.62 622.73±4.45 210.75±2.780

2.2 心肺復蘇后血清EPO水平的變化 S組有創操作術后（2h、4h、6h）EPO水平比較術前（0h）增高（P＜0.01）。C組中2h、4h組與0h組相比較均明顯增高（P＜0.01），復蘇后6h與0h組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。EPO組因給予rhEPO，檢測血清EPO無意義，故未檢測。見表3。

2.3 各組間心功能指標變化 各組間心率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與S組比較，C組、EPO組復蘇后MAP降低 （P＜0.01）；與S組相比較，C組、EPO組±dp／dtmax及LVSP均下降 （P＜0.01，P＜0.05），C組及EPO組LVEDP均升高（P＜0.01，P＜0.05）；EPO 組各時間點±dp／dtmax及LVSP均高于C組（P＜0.05）；EPO組各時間點LVEDP有所下降（P＜0.05）。見圖1－6。

表3 假手術組與常規復蘇組EPO水平比較（pg／mL，±s，n＝18）

表3 假手術組與常規復蘇組EPO水平比較（pg／mL，±s，n＝18）

注：△與術前0h組比較，P＜0.01；＊與假手術組同時間點比較，P＜0.01

時間（h） 假手術組 常規復蘇組0 664.33±218.04648.30±220.04 2 1 737.1±212.32△ 2 717.7±403.51△＊4 1 822.6±221.12△ 1 431.6±486.13△6 1 906.2±323.14△650.3±253.62

2.4 常規復蘇后組血清EPO的表達與±dp／dtmax、LVSP及LVEDP的相關性 EPO與±dp／dtmax、LVSP呈顯著正相關，r值分別為0.603、0.722、0.765，差異有統計學意義（P＜0.01）；與LVEDP呈顯著負相關，r值為－0.920，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討 論

心肺復蘇作為挽救生命的重要手段已經歷了四十多年的歷程，國際心肺復蘇及心血管急救指南2000年面世以來至今已經過三次修訂，最終目的是為了提高心肺復蘇成功率以及降低復蘇后并發癥的發生率。CPR期間心臟冠狀動脈血流銳減，僅為平時血流的20%［7］，有數據顯示約有1／3心肺復蘇自主循環恢復的患者最終死于心功能不全［8］。復蘇后心功能不全是復蘇后最重要的并發癥，其形成與心肌頓抑有關。

EPO是一種能促進紅細胞生成的多肽類激素，一種酸性糖蛋白。近期研究發現EPO是一種重要的細胞保護因子，其生理學作用也由單純的促進紅細胞生成、增加紅細胞容量擴展到可以對缺血缺氧性損傷的大腦、腎臟和心臟等多種組織器官起保護作用［9－10］，尤其對心血管系統的細胞保護作用已引起了廣泛的關注。EPO改善心功能的作用在多種急性心肌缺血和／或再灌注動物模型中得到證實［11］。江慧琳等［12］對EPO在復蘇后心功能不全相關實驗中證實EPO可以改善窒息性大鼠心臟驟停—心肺復蘇成功后的心功能并減輕心肌損傷。Doue等［13］相關實驗發現再灌注后單劑量EPO可以抑制心功能下降。Cai等［14］在缺血再灌注相關實驗中觀察到EPO可抑制心肌細胞凋亡及改善心功能，由此可見，EPO可能通過抗凋亡改善心功能。

本實驗結果顯示假手術組2h、4h、6hEPO較術前升高（P＜0.01），其原因可能與下丘腦—垂體—腎上腺皮質系統以及交感—腎上腺髓質系統有關，也與血中ACTH濃度迅速增高、糖皮質激素的生成增多及L茶酚胺量相應增加有關，表明重大創傷應激可刺激機體產生內源性EPO，屬機體保護機制。常規復蘇組EPO呈先增后降趨勢，且復蘇后2h水平高于假手術組（P＜0.01）。其原因推測與缺氧后細胞內的自由基活性氧（ROS）增多，引起EPO表達增加［15］有關。同時，腎上腺素刺激內源性EPO的表達增加［16］。隨著再灌注時間延長，超過其代償極限，腎上腺素作用消退，從而導致EPO的表達下調。相關性分析提示心肺復蘇術后血清EPO與±dp／dtmax、LVSP均呈正相關，與LVEDP呈負相關，差異均有統計學意義（P＜0.01）。提示內源性EPO的消耗可能是引起復蘇后心肌功能不全的發病機制之一。本實驗還通過復蘇術后補充外源性EPO發現：EPO組復蘇后±dp／dtmax、LVSP、LVEDP值均高于C組同時間點，差異有統計學意義（P＜0.05），提示給予rh-EPO后可改善心肺復蘇后心功能，與文獻報道相符合。其機制可能是通過STAT-5下調促凋亡蛋白基因如Bax和Caspase-3等基因的表達，發揮抗凋亡作用［17］。另外，C組EPO值于復蘇后6h降至復蘇前EPO水平，可作為靜脈補充EPO的實驗依據。

綜上所述，重大創傷應激可促使血清中EPO在短期表達增高；內源性EPO大量消耗可能是復蘇后心功能不全的發病機制之一；外源性補充EPO可明顯改善復蘇后心功能不全，但其改善心肌功能的作用是否與腎素—血管緊張素系統有關，有待進一步實驗研究證實。

［1］ Cai Z，SemenzaGL.Phosphatidylinositol-3-kinase sirgnaling is required for erythropoietin-mediated acute protection against myocardial ischemia／reperfusion injury［J］.Circulation，2004，109（17）：2050-2053.

［2］ Parsa CJ，Kim J，Riel RU，et al.Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart：a potential role for cardiac fibroblasts［J］.J Biol Chem，2004，279（20）：20655-20662.

［3］ Lipsic E，Van der Meer P，Henning RH，et al.Ti ming of erythropoietin treatment for cardioprotection in ischemia／reperfusion［J］.J Cardiovasc Pharmaclo，2004，44（4）：473-479.

［4］ Hendrickx HH，Rao GR，Safar P，et al.Asphyxia cardiac arrest and resuscitation in rats：I Short term recovery［J］.Resuscitation，1984，12（2）：97.

［5］ Christine LK，Shan PingYu，Ling Wei，et al.The Effect of Recombinant Human Erythropoietin on Nenrovasculature Repair after Focal Ischemic Stroke in Neonatal Rats［J］.JEPT，2007，322（2）：521-528.

［6］ Lurie KG，Yannopoulos D，Mcknite SH，et al.Comparison of a 10-breaths-per-minute versus a 2-breaths-perminute strategy during cardiopulmonary resuscitation in a porcine model of cardiac arrest［J］.Respir Care，2008，53（7）：862-870.

［7］ Duggal C，Wei MH，Gazmuri RJ，et al.Reginal blood flow during closed-chest cardic resusction in rats［J］.J Appl Phsiol，1993，74：147-152.

［8］ 周厚榮，張謙，劉海健，等.血必凈對窒息大鼠復蘇后心功能不全影響的實驗研究［J］.貴州醫藥，2010，34（3）：195-198.

［9］ Ferrario M，Massa M，Rosti V，et al.Early haemoglobin-independent increase of plasma erythropoietin levels in patientswith acute myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2007，28（15）：1805-1813.

［10］ Brines ML，Ghezzi E，Keenan S，et al.Erythropoietin crosses the biood-brain barrier to protect against experimental brain injury［J］.Pro Natl Acad Sci USA，2000，97（19）：10526-10531.

［11］ Moon C，Krawczyk M，Paik D，et al.Cardioprotection by recombinant human erythropoietin following acute experimental myocardial infarction：dose response and therapeutic window［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2005，19（4）：243-250.

［12］ 江慧琳，孫明.復蘇后心功能不全［J］.現代臨床醫學生物工程學雜志，2005，11（2）：85.

［13］ Doue T，Ohtsuki K，Ogawa K，et al.Cardioprotective effects of erythropoietin in ratssubjected to ischemia-reperfusion injury：assessment of infarct size with 99mTc-armexin［J］.J Nucl Med，2008，49（10）：1694-1700.

［14］ Cai Z，Manalo DJ，Wei G，et al.Hearts from rodents exposed to intermittent hypoxiaor erythropoietin are protected against ischemia-reperfusion injury［J］.Circulation，2003，10（8）：79-85.

［15］ Gossmann J，Burkhardt R，Hartier S，et al.AngioteasiaII infusion increaese plasma erythropoletin levels via Bn angiotensinⅡtype l receptor＿dependent pathway［J］.KidneyInt，2001，60（1）：83-86.

［16］ 唐萬春，孫士杰.心肺腦復蘇急性腦血管急診－－從基礎科學到臨床實踐［M］.北京：北京科學技術出版社，2008：47-48.

［17］ Chen X，Chen Y，Bi Y，et al.Preventive eardioprotection of erythropoietin against doxorubicin-induced cardiomyopathy［J］.Cardiovase Drugs Ther，2007，21（5）：367-374.