冠心舒通膠囊對急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影響

姜麗紅，吳成哲

(1.長春中醫藥大學附屬醫院心內科，長春130021;2.長春中醫藥大學基礎醫學院研究生，長春130117)

冠心舒通膠囊系蒙古民間驗方［1］，臨床用于治療心血瘀阻型冠心病所引起的胸痛、胸悶、心慌、氣短等癥，臨床研究證實其具有較好的抗心絞痛作用，實驗研究也證實其具有抗心肌缺血、抗缺氧、降脂等作用。本文通過觀察冠心舒通膠囊對心肌梗死后大鼠缺血心肌組織VEGF、PDGF表達的影響，探討冠心舒通膠囊對急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管生成的作用。

1 材料

1.1 動物 健康Wistar大鼠(吉林大學實驗動物技術有限公司提供，批號:SCXK(吉)-2013-0001)，75只，體質量(200±30)g，實驗前正常喂養1周。

1.2 儀器 RSP-1002型動物呼吸機(江西特立麻醉呼吸設備公司)、心電示波儀(Sigma美國公司)、電子天平、恒溫水浴鍋(北京六一科技公司)、微量加樣器(芬蘭GILSON公司)、組織研磨器(德國蔡司公司)、低溫高速離心機電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(Bio-Rad美國公司)、PCR儀、熒光定量PCR儀、紫外分光光度計(Sigma美國公司)。

1.3 藥物與試劑 冠心舒通膠囊(步長制藥集團，批號:140507)、注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號:D0801320)、生理鹽水(吉林仙鶴草藥業有限公司)、肝素鈉注射液引物(中國江蘇常州生化千紅制藥有限公司)、通用RT-PCR試劑盒(北京索來寶科技有限公司)，CD34免疫組化抗體、VEGF免疫組化抗體、PDGF免疫組化抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠心肌梗死模型建立 健康Wistar大鼠適應性喂養1周后，將大鼠用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg右下腹麻醉后備皮，碘酒常規消毒，背位固定，經切開喉管進行氣管插管術，連接呼吸機，以75次/min、潮氣量0.7～0.8 mL行人工呼吸。在大鼠左胸口周圍縫合成布袋口袋，在左胸第3與第4肋骨用剪刀橫切胸口，鑷子鈍性分離，于切口處打開胸腔，兩手向下擠壓、彈壓胸腔，使心臟充分暴露在胸腔外部，剪開心包膜，在肺動脈圓錐與左心耳交界處的微下1～2 mm處用無創性縫線(5/0號線)結扎冠狀動脈左前降支，等心臟搏動稍減弱，電腦顯示Ⅱ導聯心電圖開始變化，心電圖ST段出現明顯上抬，最后抬高到弓背向上為造模成功。然后在創口周圍噴灑少許青霉素粉劑，縫合胸壁。假手術組開胸后只過線不結扎。術后給予每只大鼠腹腔內注射青霉素150萬u/(kg·d)，注射5 d，以預防感染，并在30℃條件下等大鼠自然蘇醒［2］。

2.2 給藥與分組 Wistar大鼠隨機分為5組，冠心舒通膠囊高、低劑量組(A、B)，陽性藥物對照組(貝復濟與肝素對照組C)，模型對照組(D)及假手術組(E)。每組15只，中藥組A、B 2組在心梗造模成功后，按高、低劑量給予大鼠灌胃1次/d。大鼠灌胃劑量∶低劑量組為成人每千克體質量的5倍，每只大鼠灌0.2 g/kg生藥/d;高劑量組為成人每千克體質量劑量的10倍，每只大鼠灌0.4 g/kg生藥/d，共4周;C組開胸結扎冠脈后馬上在結扎處周圍予貝復濟(bFGF)噴灑，術后始皮下注射肝素120 iU/(kg·d)，共6 d;D組于術后第2天開始每天用生理鹽水2 mL/(kg·d)灌胃1次，共4周;E組不進行任何藥物干預，常規飼料喂養4周。連續給藥4周后處死大鼠，取梗死邊緣區心肌組織，進行免疫組化檢測。

2.3 CD34免疫組織化學染色 免疫組化采用SP法，DAB顯色，其中CD34抗體濃度1∶200。染色后血管內皮細胞成黃、棕色。微血管判斷標準:按參照文獻［3］以CD34的表達來標記血管內皮，凡是染成棕黃色單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為一個血管計數，凡管腔大于8個紅細胞大小、帶有較厚肌層的血管區域的血管均不計數。以生物醫學圖像分析計數大鼠心肌梗死邊緣區新生血管數(MVC)，測定其陽性染色面積(MVD)，每張切片隨機選取5個視野，分別測定其MVC、MVD，取平均值作為本只大鼠的MVC、MVD 值。

2.4 心梗大鼠梗死邊緣區VEGF、PDGF-B蛋白的表達 按免疫組化法說明操作切片，將VEGF、PDGF-B抗體染色后的心肌組織切片采用圖像分析軟件采集數據，每組5張切片，每張切片隨機選擇2個視野，計算陽性表達數。

3 結果

3.1 冠心舒通膠囊對CD34陽性微血管數(MVC)及微血管面積(MVD)的影響 見表1。

表1 冠心舒通膠囊對CD34陽性表達及血管密度的影響(±s，n=15)

表1 冠心舒通膠囊對CD34陽性表達及血管密度的影響(±s，n=15)

注:與模型組比較:#P ＜0.05，與假手術組比較，△P ＜0.05，與低劑量組比較，▲△P＜0.05

MVC MVD假手術組 8.41 ±1.21 0.006 1 ±0.001 2組 別模型組 11.30 ±1.21△ 0.021 0 ±0.002 1陽性對照組 16.67 ±1.31#△▲ 0.040 5 ±0.003 1#△▲冠心舒通低劑量組 13.89±1.62#△ 0.027 2±0.002 8#△冠心舒通高劑量組 17.51 ±1.01#△▲ 0.041 5 ±0.002 9#△▲

3.2 對大鼠心肌梗死邊緣區VEGP、PDGF-B蛋白表達量的影響 見表2。

表2 對大鼠心肌梗死邊緣區VEGF、PDGF-B蛋白表達量的影響(±s，n=15)μm2

表2 對大鼠心肌梗死邊緣區VEGF、PDGF-B蛋白表達量的影響(±s，n=15)μm2

注:與模型組比較，#P ＜0.05;與假手術組比較，△P ＜0.05;與低劑量組比較，▲P ＜0.05

蛋白組 別 VEGF蛋白 PDGF-B假手術組 17 628.08 ±2 256.00 10 368.08 ±3 451.50模型組 20 089.07 ±3 854.65△ 17 931.07 ±2 691.91△陽性對照組 32 079.32 ±2 549.21#△▲25 132.84 ±3 189.11#△▲冠心舒通低劑量組 27 456.28 ±2 046.91#△ 20 942.91 ±2 099.19#△冠心舒通高劑量組 32 312.31 ±2 218.45#△▲26 789.61 ±2 568.23#△▲

3.3 CD34免疫組織化學染色結果 1)CD34因子表達量各組與B組相比明顯增多，與A組對比，C組、E組增多明顯;2)PDGF蛋白表達量與B組相比明顯增多，與A組對比，C組、E組表達量增多明顯，D組增多不明顯;3)VEGF蛋白表達量與A組對比，C組、E組表達量增多明顯。

4 小結

VEGF是目前為止世界上公認的最重要的促血管生成及生長因子，又稱血管通透性因子，具有改變細胞外基質，增加血管通透性，促進內皮細胞增生的生物學功能。VEGF選擇性作用于內皮細胞的特性，有特異的靶向性，和其他促血管生成因子比較，具有專一性。VEGF分泌的主要因素是缺血導致局部組織缺氧，VEGF是特異的血管內皮細胞促分裂物，以內皮細胞為特異性靶細胞，具有較強的促內皮細胞有絲分裂和血管新生的作用［4］。Wojakowski等［5］研究發現，急性心肌梗死患者體內血漿VEGF因子表達量明顯高于穩定型心絞痛患者。血小板衍化生長因子(PDGF)是一種重要的促細胞分裂劑，存在于血小板及上皮細胞和成纖維細胞?；蚣易逯邪≒DGFA、B、C、D，其中PDGF-B與血管新生作用最為密切。PDGF-B蛋白不僅可以直接促毛細血管增生，且能通過誘導VEGFmRNA的表達，從而促進血管內皮細胞的增殖，加速局部血液循環的重建［6］。PDGF受體當中含有N-乙酸氨基葡萄糖和半乳糖殘基，這些都具有蛋白酶的性質。PDGF亞基與細胞膜內的相應受體相互結合后發揮生物學效應:促進細胞增殖、進行組織修復及血管新生等［7］。

CD34是一種比較特異的血管內皮標記物，已被廣泛應用。因此本試驗采取CD34免疫組織化學染色統計陽性微血管數(MVC)及微血管面積(MVD)。研究［8-10］證實骨髓干細胞在特定環境中能被誘導分化為心肌細胞和血管內皮細胞，從而修復損傷壞死心肌，形成新生血管，改善心功能。本實驗證明，冠心舒通膠囊可以促進大鼠心肌梗死邊緣區CD34的蛋白表達，高低劑量組對VEGF、PDGF蛋白表達量有增生作用，效果優于低劑量組，但與陽性藥物對照組相比無統計學意義。說明高劑量對血管新生作用有明顯的促進作用。

［1］孫志堅.冠心舒通膠囊治療冠心病心絞痛臨床療效觀察［J］.內蒙古民族大學學報:自然科學版，2008(4):422-424.

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