核磁共振氫譜法（1H－NMR）測定西他沙星標準物質的含量

張芬芬，蔣孟虹，孫林林，毛黎順，沈文斌（.中國藥科大學藥物分析教研室，南京 0009；.上海市食品藥品檢驗所，上海 00；.江蘇柯菲平醫藥科技有限責任公司，南京 006；4.中國藥科大學藥物科學研究院，南京 0009）

核磁共振氫譜法（1H－NMR）測定西他沙星標準物質的含量

張芬芬1，蔣孟虹2，孫林林1，毛黎順3，沈文斌4＊（1.中國藥科大學藥物分析教研室，南京 210009；2.上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；3.江蘇柯菲平醫藥科技有限責任公司，南京 210016；4.中國藥科大學藥物科學研究院，南京 210009）

目的 建立核磁共振氫譜法測定西他沙星標準物質的絕對含量。方法 采用Bruker AVANCE－500型和AVANCE－300型儀器，分別以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標，西他沙星中質子信號在δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14，鹽酸吉西他濱質子信號在δ8.12，δ6.21和δ6.02，齊多夫定中質子信號在δ7.61和δ6.01作為定量峰，0.5mL DMSO－d6∶氚代鹽酸（DCl，44.8 mg·L－1）＝4∶1為溶劑，測定條件為：探頭溫度303K，譜寬11.0，中心頻率4.9，脈沖序列為zg 30°，延遲時間20s，采樣次數32次，窗函數0.3Hz。結果 在此條件下，樣品與內標鹽酸吉西他濱及齊多夫定的定量峰分離良好，進樣精密度及重復性較好，線性范圍寬，樣品與內標鹽酸吉西他濱和齊多夫定質量比分別在0.354 9～1.343 9和0.312 4～1.189 2范圍內，其線性擬合方程分別為：Y＝1.440 9X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5），Y＝1.634 6X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）。結果西他沙星的含量分別為99.26%（RSD為0.06%）和99.22%（RSD為0.17%）。結論 該方法準確、專屬、簡便、快速，適用于該藥物標準物質的絕對含量測定。

核磁共振氫譜法；西他沙星；含量測定

西他沙星（sitafloxacin，圖1A）是由日本第一制藥三共株式會社研制開發的一種新喹諾酮類廣譜抗菌藥［1］，其對大多數革蘭陽性菌、陰性菌具強大的抗菌活性，對其他對喹諾酮類藥物產生耐藥性的厭氧菌和非典型致病菌如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌及鏈球菌也有抗菌活性［2］。2008年6月30日，西他沙星正式在日本上市片劑和細顆粒劑，被批準用于治療呼吸系統及泌尿系統感染，其開發前景廣闊。目前，《中國藥典》2010年版、《美國藥典》35版（USP35－NF30）、歐洲藥典7.6版（EP 7.6）及日本藥局方16版（JP 16）均未收載西他沙星的質量標準。作為創新藥，目前報道較多的是西他沙星的藥理作用［2－4］，其理化性質及檢測方法也有報道［5－8］，如HPLC、LC／MS／MS及毛細管電泳法。HPLC測定方法準確、可靠，但需對照品才能完成定量測定［9－10］，LC／MS／MS及毛細管電泳法操作復雜。未見文獻報道用核磁共振技術對其進行含量測定。

定量核磁共振法（quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）基于各化學環境中質子吸收峰的面積與誘發的核質子數呈正比，計算公式簡單，不需特定的對照品，快速準確，特異性強及不破壞樣品［1112］，特別適合無對照品的新藥的含量測定。1HNMR檢測靈敏度高，其定量準確度可達到或接近HPLC水平［13］，已應用于醫藥［14］、化學［15］、生物［16］、食品［17］、化工［18］、農業［19］以及軍事［20］等諸領域，該方法現已被收載于《中國藥典》2010年版［21］。本文建立了1H－NMR法，以鹽酸吉西他濱（圖1B）和齊多夫定（圖1C）為內標，測定西他沙星的絕對含量。研究了溶劑、內標物、定量峰、核磁共振實驗參數的選擇對該方法結果的影響，為該標準物質的含量測定提供了一種新思路。

圖1 化學結構（數字標記處為所選定量峰）A.西他沙星；B.鹽酸吉西他濱；C.齊多夫定Fig.1 Chemical structure（marked signals were selected for quantitative analysis）A.sitafloxacin；B.gemcitabine hydrochloride；C.zidovudine

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Bruker AVANCE－500、AVANCE－300型超導核磁共振儀，采用QNP探頭；AB265－S型電子天平（Mettler Toledo公司，感量0.01mg），真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥 西他沙星，由江蘇柯菲平醫藥有限公司提供（批號101001）；齊多夫定（批號H0F263，質量分數99.0%，USP對照品）；鹽酸吉西他濱（批號G0G083，質量分數99.7%，USP對照品）；氘代二甲亞砜（99.9%氘代，Sigma－Aldrich公司）；氘代鹽酸（99.7%氘代，Sigma－Aldrich公司）；重水（99.9%氘代，Sigma－Aldrich公司）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取供試品約10 mg，內標約6.5mg，置于同一離心管內，加DMSO－d60.4mL及DCl（44.8mg·L－1）0.1mL，振蕩溶解，渦旋混勻，配制成每毫升分別含樣品及內標0.04mmol的供試品溶液，轉移至5mm標準核磁管內，即得。

2.21H－NMR測定條件 采用QNP探頭，掃描寬度（sw）：11.0ppm，中心頻率（O1P）：4.9ppm；脈沖序列：zg 30°；時間域數據點（td）：32K；測定溫度：303 K；延遲時間（d1）：20s；采樣次數（ns）：32次；窗函數（lb）：0.3Hz；每份樣品平行測定5次。

2.3 西他沙星樣品的測定 取干燥后的西他沙星樣品，按2.1項下方法制備6份供試品溶液，按2.2項下條件進行測定，采集并處理圖譜，并按下式計算樣品含量。

其中：Ix和IIS分別為西他沙星和內標定量峰積分面積；Nx和NIS分別為西他沙星和內標定量峰積分信號包含的質子數（Nx＝4，NIS＝3（鹽酸吉西他濱），NIS＝2（齊多夫定））；Mx和MIS分別為西他沙星和內標的相對分子質量；mx和mIS分別為西他沙星和內標的稱樣量；Px和PIS分別為西他沙星和內標的含量（%）。測定供試品的結果如表1和表2所示，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標時，含量均值分別為99.26%和99.22%，RSD分別為0.06%和0.17%，結果較一致。

表1 內標為鹽酸吉西他濱的西他沙星含量測定結果Tab.1 Results of gemcitabine hydrochloride for the determination of sitafloxacin

表2 內標為齊多夫定的西他沙星含量測定結果Tab.2 Results of zidovudine for the determination of sitafloxacin

2.4 專屬性考察 西他沙星樣品、內標及樣品與內標混合溶液的核磁共振氫譜如圖2所示。結果表明，樣品氫譜中的質子信號δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14可作為定量峰，內標鹽酸吉西他濱的定量峰可選δ8.12，δ6.21和δ6.02，齊多夫定的定量峰可選δ7.61和δ6.01，其混合溶液中樣品與內標各定量峰能夠完全分離，各定量信號無相互干擾。

2.5 線性及范圍 精密稱取約20，15，10，10和10 mg的西他沙星樣品，分別置于離心管中，分別取內標鹽酸吉西他濱與齊多夫定約7，7，7，10，13，6，6，6，9和12mg，精密稱定，按2.1項下方法配制5份系列溶液，按2.2項下條件進行測定，以內標與西他沙星的摩爾比X為橫坐標，以其定量峰積分面積比值Y為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：Y＝1.440 9 X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5）；Y＝1.634 6 X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）。結果表明，樣品與內標鹽酸吉西他濱和齊多夫定質量比分別在0.354 9～1.343 9和0.312 4～1.189 2范圍內，氫信號與樣品稱樣量成正比，所建立以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標的西他沙星核磁共振定量法線性關系良好。

2.6 進樣精密度實驗 取供試品溶液，按2.2項下條件連續測定6次，記錄積分面積，計算樣品與內標鹽酸吉西他濱和齊多夫定的積分面積比值的RSD（n＝6）分別為0.20%和0.15%。

2.7 重復性實驗 取相同質量濃度的西他沙星樣品適量，共6份，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.2項下條件分別在500和300MHz儀器上進行測定。結果表明，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標（n＝6）時，其含量測定值的RSD分別為0.13%和0.05%。

2.8 穩定性實驗 取同一供試品溶液分別在0，10，12和16h進樣測定，結果西他沙星與內標鹽酸吉西他濱和齊多夫定的峰面積比值的RSD（n＝4）分別為0.05%和0.04%。表明供試品溶液室溫放置16h穩定。2.9 耐用性實驗 取同一供試品溶液，分別在298，303和308K溫度下各連續測定5次。西他沙星與內標定量峰積分面積比值的RSD均為0.06%，說明在298～308K范圍內，不同溫度對樣品的含量測定結果基本無影響。

3 討論

3.1 溶劑的選擇 理想的溶劑應該對待測樣品有較好的溶解性、不與樣品相互作用且黏度小。西他沙星在磷酸中微溶，在0.1mol·L－1鹽酸、乙腈、甲醇中略溶，在無水乙醇中極微溶解，在水中幾乎不溶，根據溶解性及所選內標在二甲亞砜中較易溶解的性質，考慮用DMSO－d6作溶劑。但在實際操作過程中發現，西他沙星在DMSO－d6中溶解性較差，且活潑質子信號干擾所選定量峰，可加入重水以消其干擾，但溶解性仍未改善。根據樣品在0.1mol·L－1鹽酸中略溶的特性，考慮加入適量的DCl為溶劑。通過考查比較加入不同比例DCl后樣品的溶解性，最終確定測定溶劑為DMSO－d6∶DCl（44.8mg·L－1）＝4∶1，在此溶劑配比下，內標穩定，溶解性好，滿足定量要求。

圖2 1H－NMR圖a.西他沙星和鹽酸吉西他濱的混合溶液；b.西他沙星和齊多夫定的混合溶液；c.鹽酸吉西他濱；d.齊多夫定；e.西他沙星Fig.2 1H－NMR spectraa.mixed solution of sitafloxacin and gemcitabine hydrochloride；b.mixed solution of sitafloxacin and zidovudine；c.gemcitabine hydrochloride；d.zidovudine；e.sitafloxacin

3.2 內標的選擇 理想的內標應滿足以下條件：定量峰與樣品峰分離，溶于測試溶劑，不與待測樣品相互作用等。根據西他沙星的氫譜可選擇在低場區（5.5～7.7和8～8.5）出現信號的物質作內標。據以上條件，分別測定齊多夫定、鹽酸吉西他濱的氫譜。結果表明，鹽酸吉西他濱（δ8.12，d；δ6.21，d；δ6.02，dd）、齊多夫定（δ7.61，d；δ6.01，t）在化學位移值5.5～7.7和8～8.5的信號峰形簡單，與樣品無重疊，且鹽酸吉西他濱和齊多夫定相對分子質量較大，與西他沙星相對分子質量之比約為1∶2，所選信號均各含1個質子，作為內標稱樣量與樣品稱樣量近似，可減少稱量誤差，溶解性好，因此，選擇鹽酸吉西他濱和齊多夫定作為內標。

3.3 定量峰的選擇 所選擇的定量峰應該尖銳、孤立，性質穩定，若化合物中多個信號峰均符合條件，最好全部采用，取其平均值，以減小誤差。根據西他沙星氫譜可知，其在化學位移3～9范圍內，有4個峰（δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14）相對獨立，與鹽酸吉西他濱內標峰（δ8.12，δ6.21和δ6.02）及齊多夫定內標峰（δ7.61和δ6.01）均無重合。因此，選定δ8.69（1H，d），δ7.76（1H，d），δ3.43（1H，d）和δ3.14（1H，d）為西他沙星定量峰，δ8.12（1H，d），δ6.21（1H，d）和δ6.02（1H，dd）為內標鹽酸吉西他濱的定量峰，δ7.61（1H，d）和δ6.01（1H，t）為內標齊多夫定的定量峰。

3.4 實驗參數的選擇

3.4.1 延遲時間（d1）的選擇 脈沖延遲時間（d1）是定量實驗中非常重要的參數，要確保其足夠長（≥5 ×T1）［14］，以使原子核完全弛豫，從而使被積分的信號強度與原子核數目成正比。實驗表明，當d1≥10s后，樣品定量峰積分面積不再變化。為滿足此條件且縮短實驗時間，選擇d1為20s。

3.4.2 采樣次數（ns）的選擇 采樣次數（ns）直接影響信號的信噪比，對于1H－NMR，一般要求信噪比（S／N）≥250［12］，采樣次數越多信噪比越好，但檢測時間也越長。實驗表明，當ns≥16時，其信噪比已滿足定量分析要求，通過綜合考慮選擇ns為32。

4 結論

對于西他沙星標準物質的含量測定，由于各國藥典尚未收載質量標準且有關文獻報道較少，故對其研究具有重要意義。本文首次采用1H－NMR法，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內標，DMSO－d6∶DCl（44.8 mg·L－1）＝4∶1為溶劑，直接稱量法配制供試品溶液，在理想的實驗條件下，選擇δ8.69（1H，d），δ7.76（1H，d），δ3.43（1H，d）和δ3.14（1H，d）為西他沙星定量峰，δ8.12（1H，d），δ6.21（1H，d）和δ6.02（1H，dd）為內標鹽酸吉西他濱的定量峰，δ7.61（1H，d）和δ6.01（1H，t）為內標齊多夫定的定量峰，測得西他沙星含量分別為99.26%（RSD為0.06%）和99.22%（RSD為0.17%）。所建立的方法操作簡便、快速準確、特異性強、不破壞樣品、綠色環保，為西他沙星研發過程中標準物質含量測定提供了一種新的方法，為其質量控制研究提供實驗依據。因此，QNMR法可作為該創新藥物絕對含量的測定方法之一，也適用于其他新藥的含量測定。

［1］ Keating G M，Sitafloxacin in bacterial infections［J］.Drugs，2011，71（6）：731－744.

［2］ Gao J，Liu C X.Pharmacokinetics of 22new molecular entity drugs approved in 2008［J］.Asian J Pharma Cokinet Pharm，2009，9（2）：89－116.

［3］ 石功名，陳向東，汪輝，等.西他沙星與莫西沙星抑制細胞內外金黃色葡萄球菌的活性研究［J］.中國抗生素雜志，2012，37（11）：867－880.

［4］ 胡云建，陳東科，陶鳳蓉，等.西他沙星的體外抗菌作用研究［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（1）：52－58.

［5］ 朱光宇.HPLC法測定西他沙星的含量及有關物質［J］.安徽醫藥，2011，15（12）：1512－1513.

［6］ 徐小平，王曙，賀英菊，等.LC／MS／MS技術對西他沙星代謝物結構的研究［J］.中國抗生素雜志，2001，26（2）：108－111.

［7］ 袁佩，林蕾，范琦，等.西他沙星差向異構體的毛細管電泳分離［J］.色譜，2006，24（5）：513－515.

［8］ Suzuki T，Terada K.Elucidation of the crystal structure－physicochemical property relationship among polymorphs and hydrates of sitafloxacin，a novel fluoroquinolone antibiotic［J］.J Int Pharm，2012，422（1）：1－8.

［9］ 張婷婷，趙軍，楊蒙蒙，等.HPLC法同時測定中藥復方乳膏中鹽酸小檗堿和阿魏酸的含量［J］.西北藥學雜志，2014，29（3）：245－247.

［10］ 黃萍，高林，司馬磊，等.高效液相色譜法測定四環素片含量的方法改進［J］.西北藥學雜志，2014，29（3）：255－257.

［11］ 胡敏，胡昌勤，劉文英.核磁共振波譜法測定藥物基準物質的絕對含量［J］.分析化學，2004，32（4）：451－ 455.

［12］ 于小波，沈文斌，相秉仁.定量核磁共振技術及其在藥學領域中的應用進展［J］.藥學進展，2010，34（1）：17－23.

［13］ Holzgrabe U，Deubner R，Schollmayer C，et al.Quantitative NMR spectroscopy－applications in drug analysis［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，38（5）：806－812.

［14］ Holzgrabe U.Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications［J］.J Prog Nucl Magn Reson Spectrosc，2010，57（2）：229－240.

［15］ Rizzo V，Pinciroli V.Quantitative NMR in synthetic and combinatorial chemistry［J］.J Pharm Biomed A－nal，2005，38（5）：851－857.

［16］ Fielding L.NMR methods for the determination of protein－ligand dissociation constants［J］.J Prog Nucl Magn Reson Spectrosc，2007，51（4）：219－242.

［17］ Ohtsuki T，Sato K，Sugimoto N，et al.Absolute quantitative analysis for sorbic acid in processed foods using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.Anal Chim Acta，2012，734：54－61.

［18］ Flores I S，Godinho M S，de Oliveira A E，et al.Discrimination of biodiesel blends with1H NMR spectroscopy and principal component analyses［J］.Fuel，2012，99：40－44.

［19］ Bekiroglu S，Myrberg O，?stman K，et al.Validation of a quantitative NMR method for suspected counterfeit products exemplified on determination of benzethonium chloride in grapefruit seed extracts［J］.J Pharm Biomed Anal，2008，47（4）：958－961.

［20］ Tahara M，Sugimoto N，Suematsu T，et al.Quality control of organophosphorus pesticide isoxathion oxon based on qNMR［J］.JPN J Food Chem Safety，2009，16：28－33.

［21］ 國家藥典委員會，中國藥典2010年版［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：81－83.

Quantitative determination of sitafloxacin hydrate by proton nuclear magnetic resonance（1H－NMR）

ZHANG Fenfen1，JIANG Menghong2，SUN Linlin1，MAO Lishun3，SHEN Wenbin4＊（1.Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China；3.Jiangsu Carefree Medicinal Limited Company，Nanjing 210016，China；4.Pharmaceutical Research Institute，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Abstract：Objective To establish a novel method to determine the absolute content of sitafloxacin hydrate by1H－nuclear magnetic resonance（1H－NMR）.Methods The ideal spectra were obtained by Bruker AVANCE－500and AVANCE－300in 0.5mL solutions of DMSO－d6∶hydrochloric acid－d（DCl，44.8mg·L－1）＝4∶1，with gemcitabine hydrochloride and zidovudine as internal standards（IS），signals atδ8.69，δ7.76，δ3.43andδ3.14of sitafloxacin，δ8.12，δ6.21andδ6.02of gemcitabine hydrochloride and δ7.61andδ6.01of zidovudine were selected for quantitative analysis with detection conditions as follows：the probe temperature was 303Kand spectrum width（SW）was 11.0with center frequency（O1P）at 4.9，the pulse sequence was zg 30°，delay time（d1）was 20s，number of scans（ns）was 32，and line broadening（lb）was 0.3Hz.Results The sample and internal standards i.e.gemcitabine hydrochloride and zidovudine showed good separation，high precision and repeatability.The linearity ranges with equations，Y＝1.440 9 X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5）and Y＝1.634 6 X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）were in the mass ratio range of 0.354 9－1.343 9and 0.312 4－1.189 2.The contents of sitafloxacin hydrate were 99.26%（RSD＝0.06%）and 99.22%（RSD＝0.17%），respectively.Conclusion This method was accurate，specific，simple，and rapid and can be used for the quantitative determination of the absolute content of sitafloxacin hydrate.

proton nuclear magnetic resonance（1H－NMR）；sitafloxacin hydrate；determination

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.010

R927.2

A

1004－2407（2015）02－0137－05

2014－09－10）

張芬芬，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：沈文斌，男，副研究員