PMLA－PEG－TAT納米接枝物的合成和生物活性研究

郭松巖，崔明鳳，周 青，喬友備，吳 娟，桑廣澤，王玉琨＊，吳 紅＊（.第四軍醫大學藥學院藥物分析學教研室，西安 7003；.第四軍醫大學西京醫院婦產科，西安 7003）

PMLA－PEG－TAT納米接枝物的合成和生物活性研究

郭松巖1，崔明鳳1，周 青1，喬友備1，吳 娟2，桑廣澤1，王玉琨1＊，吳 紅1＊（1.第四軍醫大學藥學院藥物分析學教研室，西安 710032；2.第四軍醫大學西京醫院婦產科，西安 710032）

目的 合成藥物載體聚蘋果酸（PMLA），制備納米接枝物PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／Doxorubicin（DOX），研究PEG對穿膜肽的保護作用及入胞特性。方法 以L－天冬氨酸為原料合成PMLA，將不同相對分子質量聚乙二醇（PEG5000）和PEG2000－TAT分別通過腙鍵和酰胺鍵與PMLA相連。阿霉素（DOX）作為模型藥物，通過酰胺鍵與PMLA相連。采用Hela細胞研究納米接枝物的細胞毒性和細胞內攝作用。結果 成功制備了藥物載體PMLA和納米接枝物PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX，篩選出當TAT含量為0.3%（TAT與PMLA的摩爾比，mol／mol）可發揮很好地穿膜入胞作用，PEG5000含量為3.2%（PEG與PMLA的摩爾比，mol／mol，下同）時對0.3%TAT有很好的保護作用，激光共聚焦實驗（CLSM）驗證了MTT實驗結果。結論 一定量PEG5000對TAT有很好的保護作用，為后續去保護后，TAT發揮高效入胞作用提供前期研究基礎。

TAT；聚乙二醇；聚蘋果酸；納米接枝物

納米藥物載體在癌癥化療領域具有巨大潛力［14］。以前藥形式組成的聚合物納米藥物通過共價鍵與聚合物鍵合后，在血液循環過程中相對穩定，載藥率可控，藥物連續釋放，不會出現暴釋現象［5］。聚蘋果酸（PMLA）是由多個單位蘋果酸組成的一種線性陰離子C4－聚酯，其中α位具有懸掛羧基，β位具有酯形式的羧酸鹽。PMLA的代謝產物蘋果酸是三羧酸循環的一種中間體，故具備生物可降解性、生物組織相容性、無免疫原性的特點［6］。同時，PMLA具有多個懸掛羧基，可共價連接多種不同生物學功能的基團［78］。因此，PMLA是一種非常有潛力的聚合物藥物載體。但研究中發現，PMLA較強的負電性（－30mV）影響了其攜帶抗腫瘤藥物進入細胞的能力。配體受體介導的靶向藥物體系本身存在缺陷，例如：腫瘤細胞有可能通過基因突變改變受體表型，從而使配體與受體無法結合，導致無法發揮靶向作用［9］。為了解決PMLA的入胞難題而提高納米接枝物的抗腫瘤效率，引入細胞穿膜肽。

細胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）是20世紀中期開始認識到的一類具有生物膜穿透功能，可攜帶其他分子甚至超分子顆粒進入細胞中的短肽［1011］。其中，TAT是最先被發現并被證實的具有穿膜功能的多肽分子，它源于人類免疫缺陷病毒（HIV－1）的反式激活蛋白中的一段特殊氨基酸序列［12］。具有凈正電荷性和兩親性，并可以攜帶其本身數倍甚至數十倍相對分子質量的物質進入細胞，但由于其可以導入幾乎所有的細胞，這種非選擇特異性導致其腫瘤蓄積較低。

因此，本研究選用PMLA為載體，利用不同相對分子質量PEG實現對穿膜肽的保護。TAT通過短鏈PEG2000與PMLA連接，長鏈PEG5000通過pH敏感的腙鍵與PMLA連接以實現對TAT的保護。在正常組織pH環境下，TAT隱蔽在長鏈PEG5000中；當納米接枝物到達腫瘤區域，腫瘤弱酸環境下（pH6.0）腙鍵斷裂，失去長鏈PEG5000保護作用，TAT裸露在外進而發揮穿膜作用，從而提高藥物載體的入胞率。PEG的存在，有利于納米接枝物在體內的長循環，使得更多的納米接枝物在腫瘤部位聚積，但體內過多的PEG會產生抗PEG抗體，這種抗體會導致藥物載體失去作用［13－14］，因此控制PEG的含量至關重要。本研究通過MTT與CLSM實驗對PEG含量進行優化和篩選，為上述構想奠定工作基礎。納米接枝物的示意圖見圖1。

圖1 納米接枝物的示意圖Fig.1 Schematic presentation of the nanoconjugate

1 儀器與試藥

1.1 儀器 核磁共振波譜儀（美國Bruker公司，400MHz，1H－NMR）；RCT型磁力攪拌器（德國IKA公司）；Hei－VAPI旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；BIO－RAD酶聯免疫檢測儀（美國伯樂公司）。

1.2 試藥 L－天冬氨酸，購自上海楷洋生物技術有限公司；苯甲酸四乙基銨，參考文獻方法，實驗室自制；NH2－PEG2000－MAL，mPEG5000－NH2，購自西安瑞喜生物有限公司；二環己基碳二亞胺、N－羥基琥珀酰亞胺、2－HEH、MTT、胎牛血清，購自Sigama－aldrich公司；細胞穿膜肽TAT，購自上海強耀生物有限公司；胰蛋白酶和DMEM，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；硫酸、氯仿、二氧六環、二氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃、苯甲醇，均為分析純，購自國藥集團上海化學試劑有限公司；三氟乙酸酐，購自濟南萬興達化工有限公司，為分析純試劑。

2 方法

2.1 聚蘋果酸的合成 參考課題組前期工作［15］，并加以改進，將L－天冬氨酸和溴化鈉溶于2mol·L－1硫酸，逐滴加入亞硝酸鈉溶液，經重氮化反應生成溴代丁二酸；將得到的溴代丁二酸溶于無水四氫呋喃中，逐滴加入三氟乙酸酐，室溫反應3h后得到溴代丁二酸酐；再把得到的溴代丁二酸酐溶于無水四氫呋喃中，加入苯甲醇45℃油浴反應12h；減壓蒸餾除去溶劑，用2mol·L－1的氫氧化鈉調節pH至7.4，1∶1加入無水二氯甲烷，45℃油浴反應24h，分離，水洗3次，經硅膠柱（規格：3，粒度：300～400目的柱層析硅膠填充）分離純化得到質量分數較高的β－芐氧羰基－β－丙內酯。向所得β－芐氧羰基－β－丙內酯中加入苯甲酸四乙基銨溶液，真空聚合后得β－聚蘋果酸芐基酯；將β－聚蘋果酸芐基酯溶于1，4－二氧六環，加入鈀碳氫化于乙醚中沉淀，得到白色產物聚蘋果酸。

2.2 PMLA－PEG2000－TAT／DOX的合成 取116mg PMLA溶于12mL無水DMSO中，同時稱取38.4mg DCC（0.2mmol）和23mg NHS（0.2mmol）加入反應液中，室溫攪拌反應12h；與此同時，取相應比例的TAT與MAL－PEG－NH2溶于DMSO中，室溫攪拌反應12h得到NH2－PEG2000－TAT；將反應所得NH2－PEG－TAT溶液加入PMLA反應液中，室溫攪拌12h，得到PMLA－PEG2000－TAT；取50mg DOX加入反應液中，室溫避光攪拌反應24h；反應后用無水DMSO透析1d，用蒸餾水透析2d后，將透析袋內的溶液冷凍干燥，得到紅色固體PMLA－PEG2000－TAT／DOX。

2.3 PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX的合成 合成路線見圖2，稱取116mg PMLA溶于12mL無水DMSO中，同時稱取38.4mg DCC（0.2mmol）和23mg NHS（0.2mmol）加入反應液中，室溫攪拌反應12h；與此同時，稱取相應比例的PEG5000－CHO與2－HEH（摩爾比1∶5）溶于無水乙醇反應液中，室溫反應12h；將所得產物旋干，與PMLA－NHS反應液合并，室溫反應12h，得到PMLA－Hyd－PEG5000；取相應比例的TAT與MALPEG2000－NH2溶于DMSO中，室溫攪拌反應12h得到NH2－PEG2000－TAT；將反應所得NH2－PEG－TAT溶液加入PMLA－Hyd－PEG5000反應液中，室溫攪拌12h得到PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT；取50mg DOX加入反應液中，室溫避光攪拌反應24h；反應后用無水DMSO透析1d，用蒸餾水透析2d后，將透析袋內的溶液冷凍干燥，得到淡紅色固體PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX。

圖2 PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX的合成路線Fig.2 Synthetic route of PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX

2.4 結構表征 采用1H－NMR表征PMLA。

2.5 細胞毒性研究

2.5.1 PMLA－PEG2000－TAT／DOX的細胞毒性研究收集對數期的Hela細胞，調節細胞懸液濃度為1 ×105個·mL－1，在96孔板上每孔種200μL，加入不同比例TAT的PMLA－PEG2000－TAT／DOX（TAT與PMLA上羧基摩爾比為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，DOX＝10μg·mL－1），每組設定3個復孔并設定空白對照。培養24h后，每孔加入MTT溶液（5mg·mL－1），繼續培養4h，倒掉培養液，加入200μL DMSO溶液，震蕩10min后，用酶標儀在490nm處測每孔A值。

2.5.2 PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX的細胞毒性研究 收集對數期的Hela細胞，調節細胞懸液濃度為1×105個·mL－1，在96孔板上每孔種200μL，加入不同比例、不同濃度的PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX，每種濃度的納米接枝物設定3個復孔為空白對照。培養24h后，每孔加入MTT溶液（5mg·mL－1），繼續培養4h，倒掉培養液，加入200μL DMSO溶液，震蕩10min后，用酶標儀在490nm處測每孔A值。

2.6 細胞攝取實驗 將Hela細胞計數后用DMEM培養基（體積分數10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素100U·mL－1）接入激光共聚焦培養皿，接種密度為104／孔，24h后加入不同含量的納米接枝物，孔內DOX濃度為0.003μmol·mL－1，于37℃、5%CO2，孵育4h后，用PBS（pH7.4）洗3遍，用40g·L－1多聚甲醛固定后，用DAPI染核，PBS緩沖液洗3次，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察藥物入胞情況。

3 結果

3.1 PMLA與PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX的合成與結構表征 PMLA合成是通過陰離子開環聚合，文獻中報道的MLABz的產率通常在15%左右［15］，本課題通過前期提純反應物，控制反應時間及反應溫度等將產率提高至30%～35%。PMLA核磁圖譜中2.92為亞甲基氫，5.38為次甲基氫，證明PMLA合成成功。見圖3。PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX由于有多肽的存在，無法進行核磁表征，其結構可通過生物學實驗予以證明。

圖3 PMLA的核磁圖譜Fig.3 1H－NMR spectrum of PMLA

3.2 細胞毒性研究

3.2.1 PMLA－PEG2000－TAT／DOX中TAT含量的研究 通過MTT實驗篩選出納米接枝物中TAT的最佳含量，結果表明該納米接枝物中當TAT的含量為0.3%及以上時，細胞毒性較0.1%和0.2%提高；當TAT含量大于0.3%時，納米接枝物細胞毒性并沒有顯著提高。見圖4。

圖4 不同含量TAT（TAT與PMLA的摩爾比，mol／mol）的PMLA－PEG2000－TAT／DOX的細胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of Hela cells after incubating with different TAT content of PMLA－PEG2000－TAT／DOX in various drug concentrations at 37℃for 24h

當TAT含量為0.3%（mol／mol）可發揮很好地穿膜入胞作用。由于PEG的含量會隨著TAT含量的增加而增加。而根據文獻報道，PEG含量過多時，將會降低藥物載體的利用率，我們利用TAT含量為0.3%的納米接枝物進行研究。

3.2.2 PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX中PEG含量的研究 選用TAT含量為0.3%，PEG含量為0，2%，4%和6%（PEG與PMLA中羧基的摩爾比，下同）4組納米接枝物進行細胞毒性研究。結果表明，當PEG含量為4%和6%時，納米接枝物的細胞毒性較PEG5000含量為0和2%的納米接枝物細胞毒性低，而PEG含量為4%和6%的細胞毒性無顯著差異。如圖5A。由此可以推斷，當TAT含量為0.3%，PEG含量為4%時，TAT可隱蔽在長鏈PEG中，無法發揮作用。為了更準確地找尋出PEG的最佳含量，我們選用TAT含量為0.3%，PEG含量為2.4%，2.8%，3.2%和3.6%的納米接枝物進行細胞毒性研究。結果表明（圖5B），當PEG含量為3.2%及以上時，納米接枝物的細胞毒性降低；PEG含量為3.2%與3.6%的兩組納米接枝物的細胞毒性并無顯著差異，故由此得出結論，PEG5000含量為3.2%（mol／mol）時對0.3%TAT有很好的保護作用。

圖5 不同含量PEG的PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX的細胞毒性Fig.5 Cytotoxicity of Hela cells after incubating with different PEG contents of PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX in various drug concentrations at 37℃for 24h

3.3 細胞攝取實驗 激光共聚焦顯微鏡評估細胞對不同含量PEG的納米接枝物的內攝作用見圖6（藍色為細胞核染料DAPI，紅色為阿霉素）。由圖6可知，PEG含量為3.2%及以上時，阿霉素的熒光強度較弱，說明該組藥物進入細胞的量較少。PEG含量為0時，阿霉素熒光強度最高，說明該組藥物進入細胞最多。由此說明PEG5000具有屏蔽TAT的作用，并且當PEG含量為3.2%時，屏蔽效果最好。

圖6 納米接枝物與Hela細胞在pH5.5（A），pH6.0（B），pH7.4（C）37℃共孵育4 h后的激光共聚焦照片Fig.6 Cellular uptake observed by CLSM into Hela cells after incubating with nanoconjugates in pH 5.5（A），pH 6.0（B），pH 7.4（C）for 4hat 37℃

4 討論

聚合物藥物載體分為天然高分子和合成高分子，常見的天然高分子藥物載體有殼聚糖和明膠等，具有生物相容性好、無毒、可降解等優點［5］。但存在溶解性差、藥物釋放慢等缺陷而受到局限。與天然高分子藥物載體相比，通過化學方法合成的高分子藥物載體具有易于制備、能改善難溶藥物的水溶性等優勢，并且由于其無毒性、無免疫原性，近年來受到關注。例如：PEG已被美國FDA認證用于臨床治療［16］。這些具有生物相容性的高分子材料作為小分子藥物的載體，可以在病灶部位有選擇性地釋放藥物，極大地提高了藥物的利用率。PMLA具有上述作為藥物載體的合成高分子材料的特點，其降解產物為人體三羧酸循環中間產物，利于代謝。本課題以聚蘋果酸為藥物載體，鍵合抗腫瘤藥物阿霉素制備聚合物前藥PMLA－DOX，但由于PMLA帶有較強的負電荷，不利于攜帶藥物入胞。因此，本研究引入細胞穿膜肽TAT提高藥物載體的入胞效率。但是由于其非特異性降低了運載效率，增加了藥物的毒性和不良反應［17］。利用酸敏腙鍵鍵合長鏈PEG對TAT進行屏蔽，使TAT在正常生理pH環境下難以發揮作用，降低不良反應。實驗結果表明，長鏈PEG具有屏蔽TAT的功能。由于PEG具有不可降解性、并會引起機體過敏等缺點［13－14］，所以控制PEG的用量也至關重要。

本研究通過體外生物學實驗得到結論，當PEG含量為3.2%時，能夠有效地屏蔽含量為0.3%的TAT，有望在體內實驗中達到最大的腫瘤蓄積從而提高藥物的抗腫瘤效率。細胞內攝取實驗同樣證實了上述論點，通過激光共聚焦實驗可知，隨著pH下降，PEG5000發生斷裂使TAT裸露并發揮作用，從而提高了藥物的入胞率。所以，用腙鍵連接PEG屏蔽TAT，使其在pH7.4正常生理環境下無法發揮作用，以實現對腫瘤細胞的靶向介導。未來，我們將繼續進行納米接枝物的TAT去保護實驗，為體內抗腫瘤應用奠定基礎。

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TAT－conjugated poly（β－malic acid）－poly（ethylene glycol）nanoconjugate：synthesis and biological evaluation

GUO Songyan1，CUI Mingfeng1，ZHOU Qing1，QIAO Youbei1，WU Juan2，SANG Guangze1，WANG Yukun1＊，WU Hong1＊
（1.Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China；2.Department of Gynaecology and Obstetrics，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China）

Objective The drug carrier of poly（β－malic acid）（PMLA）was synthesized to afford a novel nanoconjugate named poly（β－malic acid）－hydrazone bond－poly（ethylene glycol）5000（PEG5000）／PEG2000－TAT peptide／doxorubicin（DOX）for active tumor targeting.Methods The drug carrier PMLA was synthesized by L－aspartic acid.Different molecular weight PEGs were conjugatedwith PMLA by hydrazone bond and amide bond，respectively.The cytotoxicity and the cellular uptake assay were conducted by Hela cells.Result PMLA and nanoconjugate PMLA－Hyd－PEG5000／PEG2000－TAT／DOX were successfully prepared.The appropriate content of PEG（3.2%，mol／mol）was screened for hiding of TAT（0.3%，mol／mol）by cytotoxicity assay.The CLSM assay confirmed the result.Conclusion The TAT peptide was effectively protected by the appropriate content of PEG5000.This study provided an early foundation for the TAT peptide efficiently exerted cellular uptaking when the PEG5000was taken off.

TAT；poly（ethylene glycol）；poly（β－malic acid）；nanoconjugate

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.022

R914

A

1004－2407（2015）02－0176－06

2014－11－20）

國家自然科學基金項目（編號：81271687）

郭松巖，男，在讀碩士研究生

＊通信作者：吳紅，女，教授，博士生導師；王玉琨，男，教授，碩士生導師