大鼠腎發育中Wnt4蛋白的表達

程文志，唐春光，宋小峰

大鼠腎發育中Wnt4蛋白的表達

程文志1,2，唐春光1,2，宋小峰1△

目的探討大鼠腎發育中Wnt4蛋白的表達規律及Wnt4蛋白對大鼠腎發育的影響。方法選取胚齡（E）18、20 d和生后（P）0、1、3、5和7 d的大鼠腎臟，應用免疫組織化學技術，定性分析該時間段內大鼠腎組織中Wnt4蛋白的表達部位及其變化情況；應用蛋白印跡檢法，定量分析該時間段內大鼠腎組織中Wnt4蛋白表達量的變化。結果免疫組化結果顯示，從E 18 d～P 7 d，Wnt4蛋白在近端小管，在生腎區的輸尿管芽、逗號小體以及S小體的表達較強，在遠端小管的表達較弱，在腎小體的表達由強到弱。蛋白印跡檢測結果顯示，Wnt4蛋白的表達量E 18 d時開始逐漸降低，P 1 d時到達低點，然后開始回升，P 7 d時再次降低。結論在大鼠腎發育中，Wnt4蛋白通過啟動經典的Wnt/β-catenin信號通路參與調控腎單位的發育，啟動非經典的Wnt/PCP信號通路參與調控近端小管的延長，其可能與腎單位的形成以及近端小管的發育密切相關。

腎小管，近端；Wnt蛋白質類；大鼠,Sprague-Dawley；動物實驗；Wnt信號通路；腎發育

Wnt信號通路由Wnt基因調控，在生物進化上高度保守，廣泛存在于各種動物體內［1-2］。Wnt基因編碼的分泌型Wnt糖蛋白是Wnt信號通路的起始蛋白。Wnt蛋白通過與膜受體結合進行信號轉導［3］。Wnt信號通路在胚胎發育中調控細胞的增殖、分化、極性和遷移等［4］。根據信號轉導方式的不同，Wnt信號通路可分為經典的Wnt/β-catenin、非經典的Wnt/ PCP和Wnt/Ca2+信號通路三類［5］。

目前，有關Wnt信號通路在大鼠腎發育中作用的研究尚少見，其對腎發育影響的研究有待深入。本研究旨在探討Wnt4蛋白在大鼠腎發育中的表達部位和水平及其對大鼠腎發育的影響，為臨床腎臟

病理學的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料健康清潔級SD大鼠12只，雌、雄各半，體質量250～300 g，月齡5個月，購于遼寧醫學院實驗動物中心；小鼠抗大鼠Wnt4抗體［Wnt-4（B-6）:sc-376279］和小鼠抗大鼠β-actin內參抗體［β-actin（C4）:sc-47778］購于Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）抗體-HRP（PV-6002二步法免疫組化檢測試劑）購于中杉金橋公司；Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）購于Jackson Immuno Research公司。

1.2 實驗取材SD大鼠雌、雄同窩飼養，每日6：00、12：00及18：00觀察受孕情況，觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡0 d（embryonic day 0，E 0 d）。孕鼠分籠飼養2周后，每日8：00和20：00觀察生產情況，觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后0 d（postnatal day 0，P 0 d）。選取E 18、20 d的胎鼠和P 0、1、3、5和7 d的仔鼠，各齡每組取6只。各孕齡鼠經腹腔注射水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，各齡胎鼠剖腹取腎；生后各齡仔鼠經乙醚麻醉后，剖腹取腎；左腎常規脫水透明，石蠟定向包埋，連續切片4 μm；右腎放入-80℃的冰箱中凍存備用。

1.3 免疫組化染色將石蠟切片脫蠟至水；用3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶；高溫高壓修復抗原，室溫下冷卻后加小鼠抗大鼠Wnt4抗體（1∶100）；以PBS代替一抗作陰性對照，濕盒內4℃過夜；加羊抗小鼠IgG抗體HRP，37℃20 min；DAB顯色；蘇木精復染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。觀察到棕黃色顆粒為陽性。

1.4 蛋白印跡檢測分別取-80℃凍存的各個時間點的大鼠腎組織5 g，清洗后將組織剪碎，勻漿；-20℃下20 000 r/min離心5 min后取上清液，加入考馬斯亮藍，測定并配平蛋白濃度。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后，轉膜、封閉，加一抗（小鼠抗大鼠的Wnt4抗體和β-actin內參抗體，1∶500），4℃孵育過夜，加入二抗［Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L），1∶20 000］，室溫下孵育2 h，滴加SuperSig?nal West Pico化學發光底物后觀察顯色，用Scion Image Beta 4.0.3圖像灰度分析軟件分析，以β-actin作為內參校正。

1.5 統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果在E 18 d和E 20 d時，Wnt4蛋白在近端小管和腎小體，以及生腎區的輸尿管芽、逗號小體和S小體表達較強，在遠端小管表達較弱。在P 1 d～5 d時，Wnt4蛋白在近端小管和生腎區的輸尿管芽，逗號小體和S小體的表達較強，但遠端小管表達較弱，腎小體則表達較弱。P 7 d時，隨著生腎區的消失，Wnt4蛋白在近端小管表達較強，遠端小管表達較弱。見圖1。

2.2 蛋白印跡檢測結果E 18 d、E 20 d、P 0 d、P 1 d、P 3 d、P 5 d及P 7 d Wnt4蛋白的相對表達水平分別為0.661±0.087、0.576±0.065、0.508±0.073、0.283± 0.021、0.469±0.032、0.451±0.031及0.237±0.015（F= 27.535，n=6，P＜0.05）。Wnt4蛋白的相對表達水平從E 18 d時開始逐漸降低，P 1 d到達低點，然后開始回升，到P 3 d時停止回升，P 7 d時，Wnt4蛋白的表達量降到略低于P 1 d時的表達量，見圖2。

Fig.2Expression levels of Wnt4 protein in rat kidney tissue at different time points圖2 大鼠腎組織中Wnt4蛋白的表達

3 討論

哺乳動物的后腎是永久腎。后腎是在輸尿管芽和生后腎原基的相互誘導下，由生后腎原基分化為腎小體和腎小管，輸尿管芽則逐漸分化為輸尿管、腎盂、腎盞和集合管后，發育為成熟的腎臟［6］。

已有研究表明，Wnt蛋白家族的許多成員參與腎發育的調控［7］。其中Wnt4蛋白通過經典和非經典的Wnt信號通路發揮重要的調控作用［8-9］。Wnt4蛋白由后腎間充質產生，它啟動經典的Wnt/βcatenin信號通路時，調控細胞的增殖，誘導小泡體轉化為腎小囊的上皮結構，并參與腎小管的形成［9］；啟動非經典的Wnt/PCP信號通路時，參與調節腎小管上皮細胞的極性，調控細胞的分裂和遷移，促進腎小管的延長，但不增加小管的直徑［10］。

研究認為，Wnt/β-catenin信號通路的活性是生腎區內早期腎小管形成和輸尿管芽分支所必需的，但其活性在腎單位成熟的部位逐漸減弱［11］。在小泡體或腎小囊形成的同時，其活性就轉變為非經典信號通路，調節腎小管的延長［12］。在腎發育中，Wnt/βcatenin和Wnt/PCP信號通路之間的平衡很重要，二者間的平衡被打破將導致腎發育異常，甚至是腎祖細胞分化缺陷［10］。另有研究顯示，經典信號通路的活性能抑制非經典信號通路的激活［13］。本研究結果顯示，在E 18 d～P 7 d，Wnt4蛋白在近端小管表達較強，表明Wnt4蛋白此時在腎近端小管啟動的是Wnt/PCP信號通路，調節腎小管上皮細胞的極性，進而調控近端小管的延長，提示在E 18 d～P 7 d時近端小管沒有經典的信號通路被激活。Wnt4蛋白在腎小體內的表達，在E 18 d和E 20 d時較強，在P 1 d～7 d時呈整體減弱趨勢，表明在胚胎期腎小體的

發育可能以調節上皮細胞的極性為主，生后其上皮細胞的極性已經完成，其發育可能轉變為以細胞分化為主。同時，本研究亦顯示，Wnt4蛋白在遠端小管的表達較弱，提示遠端小管的發育可能是由其他機制調控的，具體機制還有待進一步的研究。

本研究結果顯示，在E 18 d～P 7 d，Wnt4蛋白在生腎區的表達較強，表明Wnt4蛋白在生腎區啟動Wnt/β-catenin信號通路發揮作用。在腎小囊形成之前，生腎區的發育是由Wnt/β-catenin信號通路調控。因此，此時生腎區沒有非經典的信號通路被激活。

蛋白印跡檢測結果顯示，Wnt4蛋白的表達量在小鼠出生前從E18 d開始逐漸降低，在P 1 d時到達低點，考慮可能原因是由于大鼠出生后，從母體內進入自然界環境引發的應激性反應所致［14］。此外，有研究表明，腎小囊體積的增長速度在P 3 d～P 5 d時最快［15］。逗號小體和S小體的體積在生后3 d達到高峰，之后體積減小，生后7 d時消失［16］。本研究結果中，Wnt4蛋白含量的變化規律與上述文獻中所述腎小囊和腎小體的變化規律相近，表明Wnt4蛋白與大鼠腎小囊體積的增加和腎小體的形成過程有關。

綜上所述，筆者認為，在大鼠腎發育中Wnt信號通路中的Wnt4蛋白對腎單位的形成和近端小管的發育有重要的調控作用。近端小管是腎臟重吸收的重要部位，也是腎缺血再灌注損傷等腎疾病的易發部位。

（圖1見插頁）

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（2015-03-13收稿 2015-06-25修回）

（本文編輯 陸榮展）

The expression profile of Wnt4 in rat kidney during renal development

CHENG Wenzhi1,2,TANG Chunguang1,2,SONG Xiaofeng1△
1 Department of Histology and Embryology of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China；2 Library of Liaoning Medical University△

ObjectiveTo explore the expression profile of Wnt4 in rat kidney during renal development and its effect on renal development.MethodsRats with embryonic age of 18 days（E 18 d）,20 days（E 20 d）as well as postnatal age of 0 day（P 0 d）,1 day（P 1 d）,3 days（P 3 d）,5 days（P 5 d）and 7 days（P 7 d）were selected.Expression levels of Wnt4 in rat kidney during renal development were quantified by immunohistochemistry and Western blot in all time points.ResultsImmuno?histochemistry analysis showed that during E 18 d to P 7 d,Wnt4 mainly expressed in proximal tubules,ureteric bud,comma shaped bodies and S shaped bodies of nephrogenic zone；the expression in the distal tubule was weak；the expression in renal corpuscle decreased with time；Western blot analysis showed that the expression of Wnt4 in rat kidney began to decrease from E 18 d and reached bottom at P 1 d then rise again until P 7 d when it dropped again.ConclusionDuring renal development, Wnt4 proteins were involved in the development of the nephrogenic zone through regulating canonical Wnt/β-catenin signaling pathway,and was involved in extension of proximal tubules by inducing the non canonical Wnt/PCP signaling pathway.Expression of Wnt4 protein in rat kidney was closely related to nephron formation and development of proximal tubules.

kidney tubules,proximal；Wnt proteins；rats,Sprague-Dawley；animal experimentation；Wnt signaling pathway；kidney development

R334.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.011

國家自然科學基金資助項目（31200871）；遼寧省自然科學基金資助項目（201202146）

1遼寧醫學院組織胚胎學教研室（郵編121001）；2遼寧醫學院圖書館

程文志（1979），男，碩士在讀，主要從事腎的發生發育研究

△通訊作者E-mail：songxfmm@sina.com