LYVE-1在甲狀腺乳頭狀癌的表達和意義

倪孔海 金洲祥 盧明東 胡霄 葉兵 鄭志強

LYVE-1在甲狀腺乳頭狀癌的表達和意義

倪孔海 金洲祥 盧明東 胡霄 葉兵 鄭志強

目的 觀察淋巴管透明質酸受體1（LYVE-1）的表達和癌周組織中淋巴管的生成情況在甲狀腺惡性腫瘤的變化及轉移中的作用。方法 應用免疫組織化學和real-time PCR方法檢測45例甲狀腺乳頭狀癌中央區、癌周邊區和正常甲狀腺組織中的LYVE-1及其m RNA表達情況，并計算淋巴管密度（LVD）。結果 甲狀腺乳頭狀癌周邊區LVD高于甲狀腺乳頭狀癌中央區，而正常組織中很少見LYVE-1陽性的微淋巴管；甲狀腺乳頭狀癌周邊區LVD與淋巴結轉移有密切關系（P＜0.05）。結論 LYVE-1是一種特異性較高的淋巴管內皮特異性標志物，對淋巴管生成促進甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移。

甲狀腺腫瘤 透明質酸受體 聚合酶鏈反應 淋巴管生成

已有研究表明，淋巴管內皮細胞透明質酸受體－1（lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor－1，LYVE－1）的高表達對提示惡性腫瘤淋巴結轉移有一定的作用[1－3]，但在甲狀腺腫瘤方面的相關研究較少。因此，本研究觀察甲狀腺乳頭狀癌不同部位組織中LYVE－1的表達情況，旨在闡明其在甲狀腺惡性腫瘤的變化及轉移中的作用，現將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2006年至2012年在我院手術且臨床和隨訪資料完整的45例甲狀腺乳頭狀癌患者的病理標本，患者中男21例，女24例，年齡22～65歲；有頸部淋巴結轉移19例；均有癌中央區、癌周邊區甲狀腺組織的病理資料。另取10例正常甲狀腺組織（均為良性結節行腺葉切除的病灶外1cm組織）作為對照組。在光鏡下復查這些標本的組織病理蠟塊，再次明確診斷。

1.2 檢測方法和觀察指標

1.2.1 LVYE－1表達 主要試劑：兔抗人LYVE－1（上海生工公司），One Step SYBR PrimeScriptTMreal－time PCR試劑盒（Takara公司）。定量PCR系統：PRISM7000型基因擴增儀（ABI公司），red凝膠圖像分析儀（Alpha公司），DU800核酸蛋白定量分析儀（Beckman Coulter公司）。用PV－9000二步法免疫組化染色，兔抗人LYVE－1多克隆抗體工作濃度為1∶200，操作步驟按照試劑盒說明書。石蠟標本切片厚4μm，經二甲苯常規脫臘，梯度濃度乙醇脫水，3%H2O2室溫孵育10min，0.1mol/L Tris－HCl（pH=9.0）含2mmol/L EDTA抗原修復液微波中低火10min，PBS洗3次，10%正常山羊血清封閉室溫孵育20min傾去血清，勿洗，加一抗10μg/ml兔抗人LYVE－1抗體4℃孵育過夜，PBS洗3次，通用型SP Kit中生物素標記二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次，DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，脫水透明，封片。

1.2.2 LVYE-1 mRNA表達 采用real-time PCR法測定。用Trizol試劑按照說明書提取組織LYVE-1和VEGFR-3 mRNA，核酸蛋白定量分析儀測定mRNA濃度，同時測定吸光度比值（A260/A280）。若比值為1.8～2.0，證實RNA純度符合real-time PCR反應要求。將各標本RNA調至40 ng/μl，-80℃冰箱保存備用。用One Step SYBR PrimeScriptTMreal-time PCR試劑盒進行real-time PCR反應。LYVE-1上游引物（FP）為5′-ATCCCATATTCAACACTCAA-3′，下游引物（RP）為5′-CCTTTACTACTTTGGTTTCG3′；VEGFR-3引物為：FP：5′-GTATGGACTCTCGCTCAGCAT-3′，RP：5′-AGGCTCTCTTCATTGCAACAG-3′；β-actin FP：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，RP：5′-AAAACTGGAACGGTGAAGGT-3′（上海生物工程技術服務有限公司合成）。定量PCR反應體系（25μl）：2×one step SYBRBuffer 12.5μl，TaKaRa ExTaq 0.5μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 0.5μl，RNA 100ng，正反向引物各0.5μl。每個反應設兩個復孔，應用ABIPRISM7000系統進行real-time PCR測定。擴增條件為：42℃ 15min，95℃2min進行反轉錄反應，95℃5s，60℃31s，共40個循環。LYVE-1相對β-actin的表達水平采用ΔCt表示，并用SDS軟件進行分析，ΔCt=LYVE-1或VEGFR-3反應孔Ct－β-actin反應孔Ct。

1.2.3 淋巴管密度（LVD） LYVE-1免疫組化染色陽性物質主要定位于細胞質，呈棕黃色細顆粒狀。將LYVE-1染色棕黃色的內皮細胞簇或內皮細胞形成的條狀、隙狀結構及有管腔者作為1個淋巴管計數。每例標本切片首先在低倍鏡下隨機選擇3個淋巴管著色最密集的區域，然后在200倍光鏡下分別計數淋巴管個數，取3個視野的均值作為LVD。

1.3 統計學處理 應用SPSS 12.0統計軟件，計量資料以表示，組間差異比較采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織LYVE-1mRNA表達水平 癌中央區為8.4±0.9,癌周邊區為128.0±80.8，正常甲狀腺組織為1.7±0.3，甲狀腺癌周邊區中LYVE-1 mRNA表達水平明顯高于癌中央區和正常甲狀腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同甲狀腺組織LYVE-1 mRNA表達的電泳圖見圖1。

圖1 不同甲狀腺組織LYVE-1mRNA表達電泳圖（1：Marker；2：正常組織；3：癌中央區；4：癌周邊區）

2.2 不同甲狀腺組織LVD LYVE-1免疫組化染色陽性的內皮細胞圍成壁薄、形態不規則的管腔，且管腔通常呈塌陷狀，內皮細胞核大且向腔內突出，符合毛細淋巴管的形態學特征；淋巴管腔內有時可見絮狀物質、淋巴細胞、腫瘤細胞等；在腫瘤細胞及血管內皮細胞未見LYVE-1表達（圖2）。甲狀腺乳頭狀癌中央區的LVD為（7.4±2.5）個，癌周邊區為（11.4±8.6）個，正常甲狀腺組織為（0.7±0.3）個，甲狀腺癌周邊區LVD明顯高于癌中央區和正常甲狀腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 有否伴淋巴結轉移者甲狀腺乳頭狀癌周邊區LVD的比較 有轉移者（19例）甲狀腺乳頭狀癌周邊區LVD為（18.3±8.7）個，無轉移者（26例）為（9.4±5.9）個，兩者的差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌不同部位LVD（A：甲狀腺癌周邊區；B：甲狀腺癌中央區；C：甲狀腺正常組織區）

3 討論

近年來人們逐漸認識到淋巴管生成在腫瘤淋巴轉移過程中起著重要作用。淋巴管內皮標記物的發現使得區分淋巴管和血管成為可能。LYVE-1是特異性較強的淋巴管內皮細胞標志物，是透明質酸（HA）在淋巴管內皮的主要受體之一。它表達于淋巴管內皮細胞而不表達于血管內皮。可以單獨使用來檢測淋巴管內皮細胞水平。

通過LYVE-1免疫組化染色我們對腫瘤中央區和周圍區的淋巴管進行識別和計數，表明LYVE-1標記的管道具備淋巴管的形態特征，可有效地用于淋巴管標記。同時發現：甲狀腺乳頭狀癌周邊區LVYE-1 mRNA表達及LYVE-1陽性特征的LVD均高于癌中央區，有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌的LVD明顯高于無轉移的腫瘤，且瘤周邊區的LVD較正常組織增高。

一般認為腫瘤發生淋巴結轉移有以下途徑：（1）侵襲腫瘤內淋巴管或侵襲腫瘤周圍已存在的淋巴管；（2）誘導新淋巴管的生成，從而有利于轉移至鄰近的淋巴結。尤其是第二種觀點現在得到越來越多的證據支持。我們的結果發現有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌周邊區LVD明顯高于無淋巴結轉移的腫瘤，LYVE-1的表達水平明顯增高，因此我們認為癌周邊區LVD增高為腫瘤轉移提供更多的通道，是腫瘤淋巴轉移的重要機制之一。李蕾等[3]研究表明，胃癌組織內新生淋巴管主要位于癌周，而且與淋巴結轉移和遠處轉移有關，我們的結果與此相一致。淋巴管生成與患者淋巴結轉移和預后的關系在頭頸癌和口腔鱗癌中也得到了證實[4-5]。而淋巴管生成促進腫瘤轉移的可能機制為：（1）LVD增加從而使腫瘤細胞與淋巴管的接觸機會增加；（2）淋巴管的通透性、淋巴內皮細胞間的黏附力或淋巴內皮的某些化學因子、細胞因子的表達發生改變；（3）組織間液壓力發生改變、血管間隙增大、組織淋巴液增加是腫瘤細胞進入脈管循環的決定因素；（4）淋巴管生成與形態和功能發生變化的原有淋巴管的協同作用促進轉移[6-7]。

因此，淋巴管生成在甲狀腺癌的發展及淋巴結轉移過程中起著重要的作用，研究淋巴管生成及其調控機制及阻斷淋巴管生成的方法，有可能讓抗淋巴管生成治療成為一項具有良好前景的腫瘤治療措施。

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Expression of LYVE-1 in papillary thyroid carcinoma and its clinical significance

NI Konghai,JIN Zhouxiang,LU Mingdong,et al.
Department of General Surgery，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the exp ression of lymphatic vessel hyaluronan recep tor-1(LYVE-1)in pap illary thyroid carcinoma and its c linical significance.Methods The exp ression of LYVE-1 p rotein and mRNA was exam ined by immunohistochem icalmethod and real-time RT-PCR in cancer tissue,pericancerous tissue and normal thyroid tissue from 45 patients of pap illary thyroid cancer,respec tively.The density of lymph vessel in cancer tissue and pericancerous tissue was calculated.Results The density of lym ph vesselwas higher in pericancerous tissue than in cancer tissue.The LYVE-1 was little exp ressed in normal thyroid tissue.The density of lymph vessel in pericancerous tissue and the m RNA content of LYVE-1 in cancer tissue were correlated w ith lym ph node metastasis(P＜0.05).Conclusion LYVE-1 is a specific lym phatic endothelium marker,which may be associated w ith lym ph node metastasis in pap illary thyroid carcinoma.

Pap illary thyroid tumor Hyaluronan recep tor Polymerase chain reaction Lym phangiogenesis

2014-03-17）

（本文編輯：沈叔洪）

溫州市科技局資助項目（Y20080195）

325027溫州醫科大學附屬第二醫院普外科

鄭志強，E-mail：wznkh@163.com