5-脂氧合酶在小鼠惡唑酮潰瘍性結腸炎中的表達研究

鐘萬鍔 張海峰 周國雄

●基礎研究

5-脂氧合酶在小鼠惡唑酮潰瘍性結腸炎中的表達研究

鐘萬鍔 張海峰 周國雄

目的 研究5-脂氧合酶（5-LOX）在惡唑酮誘導潰瘍性結腸炎（UC）小鼠結腸黏膜中的表達情況，探討其在UC發病機制中的作用及其與炎癥程度的關系。方法 50只Balb/c小鼠分為正常對照組10只和模型組40只。模型組用3%惡唑酮致敏2d，第5天用0.5%惡唑酮灌腸。第8天用頸椎脫臼法處死所有小鼠。實驗期間觀察小鼠疾病活動指數（DAI），處死小鼠后行結腸組織學病理評分（HPS）。RT-PCR法檢測結腸黏膜5-LOXm RNA的表達，免疫組織化學方法檢測結腸黏膜5-LOX的蛋白表達情況。結果模型組DAI和HPS均高于對照組，5-LOXm RNA和蛋白表達也明顯高于對照組（均P＜0.01），并隨炎癥程度加重，表達水平明顯增高。結論 5-LOX在UC中表達水平明顯升高，并參與了UC的發生和發展，在一定程度上可反應疾病的活動度，并且可能作為藥物治療的潛在靶點。

潰瘍性結腸炎 5-脂氧合酶 RT-PCR免疫組織化學

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因、發病機制未明的反復發作的慢性非特異性腸道炎癥。目前認為其發病可能與免疫、遺傳、感染及精神等多種因素相互作用有關，免疫學因素是UC研究的熱點之一。花生四烯酸（AA）是人體的一種必需脂肪酸，參與UC炎癥發生、發展的整個過程。AA主要通過環氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）兩條途徑代謝。5-脂氧合酶（5-LOX）是AA的LOX代謝途徑的關鍵酶，可催化AA生成白三烯B4（LTB4）。LTB4與炎癥細胞上的LTB4受體相互作用，介導對中性粒細胞、單核細胞和效應性T淋巴細胞等炎癥細胞向炎癥部位趨化，LTB4被認為是UC中起主要作用的炎性介質[1]。小鼠惡唑酮結腸炎模型是一種Th2型結腸炎模型，組織學表現與人類UC相似[2]。本研究以惡唑酮誘導小鼠實驗性結腸炎模擬人類UC，評估結腸炎癥程度，通過RT-PCR和免疫組織化學的方法研究5-LOX在惡唑酮誘導小鼠UC中的表達情況，探討5-LOX在UC發病中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 雌性Balb/c小鼠50只，4～6周齡，體重16～22g，由南通大學動物實驗中心提供，飼養于南通大學動物實驗中心屏障環境。稱重、編號后隨機分為正常對照組和模型組。正常對照組10只，無需特殊處理。模型組40只，參照Heller等[3]所用方法建立惡唑酮小鼠結腸炎模型。惡唑酮購于Sigma公司，小鼠背部皮膚剃毛（2cm×2cm），皮膚滴注3%惡唑酮（溶解于100%乙醇中）0.2ml，自然風干。1d后重復滴注1次；5d后將直徑2mm的硅膠管經肛門插入腸道深約3cm，注入0.5%惡唑酮（溶解于50%乙醇中）0.15ml，注入后將小鼠倒置30s以防止回流。第8天用頸椎脫臼法處死所有小鼠。采集小鼠結腸標本備檢。根據疾病活動指數（DAI）和結腸組織學病理評分（HPS）分為輕度炎癥組5只、中度炎癥組18只和重度炎癥組17只。

1.2 結腸炎癥評詁 造模過程中每日觀察小鼠體重變化、大便性狀、便血等情況。參照Murano等[4]所列標準進行DAI評分，DAI=（體重下降分數+大便性狀分數+便血分數）/3。處死小鼠后取病變明顯處，常規石蠟包埋、切片、HE染色，觀察組織學改變，參照Wirtz等[5]所列標準進行HPS評分。

1.3 RT－PCR法測定5－LOX 提取總RNA，然后逆轉錄反應合成cDNA，取5μl cDNA用于PCR擴增。以GAPDH為內參照。GAPDH、5－LOX引物由上海生工生物科技公司設計并合成。5－LOX上游序列：5′TATCGATGGATGGATGGAGTGGAA3′，5－LOX下游序列：5′GACTGGAACATGTGCATGAAG3′，擴增產物大小為198bp。GAPDH上游序列：5′CCTCAAGATCATCAGCAAT3′，GAPDH下游序列：5′CCATCCACAGTCTTCTGGGT3′，擴增產物大小為241bp。循環參數如下，5－LOX：94℃變性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，循環45次，80℃延伸20s。GAPDH：94℃變性20s，56℃退火20 s，72℃延伸30s，循環45次，80℃延伸20s。擴增后取PCR產物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳。用凝膠分析系統對條帶作半定量分析，讀取其積分光密度（IOD）值，以5－LOX平均IOD值/GAPDH平均IOD值來表示5－LOX相對表達強度。

1.4 免疫組化方法測定5－LOX蛋白 采用Elivison二步法進行染色。加5－LOX（Caymana Chemical公司，工作濃度15μg/ml）作為一抗，每張切片加兔抗羊二抗（Jackson公司，工作濃度1∶500）。采用定量積分法，每張切片至少觀察5個高倍視野100個細胞，對每張切片的陽性細胞比例及陽性細胞著色強度分別進行計分，以胞核或胞質中發現棕黃色或褐色顆粒狀物者為陽性細胞，陰性對照應無棕黃色反應產物。采用以下染色積分評價標準[6]：染色強度分為4級，即陰性染色（0分），弱陽性染色（1分），中度陽性染色（2分），強陽性染色（3分）；每張切片按所見陽性細胞范圍分為5級，即陰性為0分，陽性細胞占1%～25%為1分，陽性細胞占26%～50%為2分，陽性細胞占51%～75%為3分，陽性細胞占76%～100%為4分。每張切片的染色積分以染色強度與陽性細胞比例乘積之和表示。

1.5 統計學處理 采用STATA 12.0統計軟件，計量數據用表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。

2 結果

2.1 兩組小鼠發病情況及DAI評分比較 對照組小鼠飲食、活動及大便性狀正常，體重略有增加。模型組小鼠造模后第1天開始出現食量和活動減少，大便表現為稀便或半稀便，體重減輕；第3天開始出現便血或大便隱血（+～++）；體重減輕更加明顯。與對照組相比，模型組DAI明顯增高，差異有統計學意義，詳見表1。

2.2 兩組小鼠組織學觀察及HPS評分比較 對照組小鼠結腸黏膜光鏡下無組織損傷表現（圖1）。模型組小鼠結腸黏膜不同程度水腫、出血、糜爛及潰瘍形成，固有層腺體變形、排列紊亂，黏膜及黏膜下層可見密集分布的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，偶見淋巴濾泡形成（圖2）。與對照組相比，模型組HPS明顯增高，差異有統計學意義，詳見表1。

表1 兩組DAI和HPS評分比較

圖1 對照組小鼠結腸黏膜光鏡下所見（HE染色，×100）

圖2 模型組小鼠結腸黏膜光鏡下所見（HE染色，×100）

2.3 兩組小鼠5－LOXmRNA表達水平比較 模型組小鼠5－LOXmRNA表達上調，對照組5－LOXmRNA僅微弱表達（圖3），兩組比較差異有統計學意義，詳見表2。

2.4 兩組小鼠免疫組化染色積分比較 在對照組小鼠結腸黏膜組織中，5－LOX無或僅有弱陽性表達（圖4），模型組與對照組比較，5－LOX表達顯著增高（圖5），差異有統計學意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 兩組小鼠5-LOXmRNA表達水平、免疫組化染色積分比較

圖3 兩組小鼠5-LOXmRNA表達電泳圖

圖4 對照組小鼠結腸標本5-LOX表達（免疫組化染色，× 400）

圖5 模型組小鼠結腸標本5-LOX表達（免疫組化染色，× 400）

3 討論

UC的病因及發病機制至今仍不清楚，多數研究認為與免疫反應異常有關，尤其與腸黏膜局部免疫反應的異常關系密切，細胞因子在UC的發病中起著多重作用。腸道免疫系統存在著一種微妙的平衡，促炎因子與抗炎因子通過精細的調節維持宿主腸黏膜的防御能力，使腸組織免遭破壞，但這種平衡一旦打破，非特異性剌激和活化的炎癥細胞均可產生并釋放大量破壞性的免疫分子及炎癥因子。各種細胞因子、炎性介質的相互作用形成復雜的甚至有自身放大作用的細胞因子網絡，促進炎癥反應，導致腸黏膜損傷，從而參與UC的發生、發展[7]。

我們的研究結果發現，在惡唑酮誘導的小鼠結腸炎模型中，5-LOX表達上調，炎癥越重，5-LOX表達越強，而對照組小鼠5-LOX不表達或弱陽性表達。5-LOX是機體生成白三烯B4（LTB4）的關鍵酶，相對分子量為78kD，普遍存在于哺乳動物的各種組織和血液細胞中，主要見于白細胞、巨噬細胞和肥大細胞，細胞不同的狀態可能有不同的5-LOX亞細胞定位[8]。5-LOX主要作用于炎癥的后期，可以調節中性粒細胞的遷移浸潤能力，促進黏附分子的表達和炎性介質的產生，增加腸黏膜滲透性，在UC組織損傷和炎癥產生過程中具有重要的作用[9]。研究發現，大鼠結腸炎模型腸黏膜中5-LOX表達水平增高，應用5-LOX抑制劑可減輕大鼠結腸的炎癥表現[10-12]。Mazzon等[13]觀察5-LOX基因敲除的結腸炎模型小鼠，發現其腹瀉和結腸炎癥程度明顯減輕，提示5-LOX與UC密切相關，5-LOX抑制劑可能對UC具有潛在的治療價值。

因此，我們認為，5-LOX參與了UC的發生和發展，5-LOX通過催化花生四烯酸（AA）生成LTB4。LTB4與炎癥細胞上的LTB4受體相互作用，介導對中性粒細胞、單核細胞和效應性T淋巴細胞等炎癥細胞向炎癥部位趨化，最終導致腸道黏膜炎癥的發生。由此可見，5-LOX在UC發病中起了重要作用，可能成為潛在治療的靶點。目前5-LOX在UC中的具體作用還不完全清楚，因此，進一步研究它們的作用機制有著重要意義。

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Expression of 5-lipoxygenase mRNA and protein in colon mucosa of mice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis

ZHONG Wane, ZHANG Haifeng，ZHOU Guoxiong.
Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001, China

Objective To investigate the exp ression of 5-lipoxygenase(5-LOX)m RNA in colon mucosa in m ice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis(UC).Methods Fifty female Balb/c m ice were divided into controlg roup(n=10)and UC g roup(n=40).Mice in UC g roup received subcutaneous injection of3%(w/v)oxazolone for 2d and subsequently received enema w ith 0.5%(w/v)oxazolone on d5 after sensitization.On d7 the m ice were sac rificed for harvestof colon sam p les;disease ac tivity index(DAI)and histopathologicalscore(HPS)were also evaluated.The exp ression of5-LOXm RNA and p rotein in colonmucosa were detected by RT-PCR and immunohistochem istry,respectively.Results The DAIand HPS were higher in UC g roup than those in controlgroup.The exp ression of5-LOXmRNA and p rotein were significantly increased in UC m ice com pared to controls (P＜0.01),and the exp ression was positively correlated w ith the severity of colonic inflammation.Conclusion The exp ression of 5-LOX is up-regulated in colon mucosa ofm ice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis,which ind icates that 5-LOXmay be involved in the developmentofUC and 5-LOXm ightbe a potentialpharmacological target for treatmentofUC.

Ulcerative colitis 5-LOX RT-PCR Immunohistochem istry

2013-12-16）

（本文編輯：沈叔洪）

226001南通,南通大學附屬醫院消化內科(鐘萬鍔現在寧波市第六醫院消化內科工作)

周國雄,E-mail：zhouguoxiong@medmail.com.cn