不同促滲劑對雷公藤紅素醇質體體外透皮吸收的研究

吳 軍，劉 荻，馬 卓

（湖北工業大學 輕工學部，湖北 武漢430068）

雷公藤是一味常用中藥材，具有殺蟲止血、舒筋活血、祛風通絡、清熱解毒、消腫止痛等功效［1］。但根據國家藥品不良反應監測中心2004－2011年的報告顯示，雷公藤制劑在治療疾病的同時也伴隨著嚴重的肝毒性、腎毒性、生殖毒性及皮膚毒性［2］，因此，亟需進一步研究雷公藤的治病機制，以便降低其毒副作用?，F階段對雷公藤的研究主要集中在雷公藤紅素的治病機理上。雷公藤紅素（Celastrol，Cel），是一種三萜類化學成分［3］（結構式見圖1），具有抑制免疫反應和抗炎的作用［4－5］，但其難溶于水、口服吸收差及毒性較大限制了它的臨床應用。醇質體具有較高的雙分子層流動性、易于變形及可穿透皮膚屏障等優點［6］，故本試驗以醇質體為載體，考察不同促滲劑對Cel醇質體體外透皮吸收的影響，篩選出最佳促滲劑。

圖1 雷公藤紅素的化學結構

1 試驗材料

1.1 儀器

CAV214C電子天平，奧豪斯國際貿易有限公司；U-3000高效液相色譜儀，戴安；TP2A型智能透皮試驗儀，鞏義市英峪予華儀器廠（擴散池參數:擴散面積1.77cm2，接受池容積18mL）；QL-901旋渦混合器，江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；KQ-300TDB型高頻數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥

Cel、Cel對照品，中科院武漢植物園，批號20130524；丙二醇、甘油，國家集團化學試劑有限公司，批號20121019；薄荷腦，南通薄荷廠，批號20140101；水溶性氮酮，武漢金信達醫藥輔料技術開發有限公司，批號20140702；甲醇，色譜純；乙醇、冰醋酸，均為分析純；吐溫80，國藥集團化學試劑有限公司，批號20121225；超純水；磷酸鹽緩沖液，PBS，pH＝7.4，實驗室自制。

1.3 實驗對象

昆明種雄性小鼠（SPF級，體重18～22g），湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號:SCXK（鄂）2008－0005。

2 方法與結果

2.1 Cel醇質體的制備

采用乙醇注入法制備醇質體［7］。精密稱取一定量Cel、蛋黃卵磷脂、膽固醇于小燒杯中，加入無水乙醇，密封，50℃恒溫水浴使其溶解，構成有機相；另取一定量超純水加入平底燒瓶中，置于磁力攪拌器（700r/min）上，構成水相。將另取26mL超純水加入平底燒瓶中，置于磁力攪拌器，攪拌速度為700r/min，攪拌溫度50℃，構成水相。在密閉條件下用注射器將有機相緩慢加入到水相中，繼續攪拌2h，自然冷卻后超聲30min，將所得混懸液用0.45μm孔徑有機系濾膜過濾，即得。

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件 Agilgent HC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫35℃；流動相為V（甲醇）∶V（1%冰醋酸）＝90∶10；檢測波長425nm；流速為1mL/min；進樣量20μm。Cel對照品、含藥接收液及空白接受液的HPLC色譜圖見圖2，空白接收液成分對樣品測定沒有干擾，表明上述色譜條件可行。

圖2 HPLC色譜圖

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取Cel對照品10 mg，置于100mL量瓶中，無水乙醇定容，得到濃度為100μg/mL的Cel儲備液。精密吸取上述儲備液1、2、4、5、6、8mL分別于10mL量瓶中，無水乙醇定容，得到濃度為10.0、20.0、40.0、50.0、60.0、80.0、100.0μg/mL的一系列標準溶液，以峰面積（A）和質量體積（C）分別為縱坐標、橫坐標，繪制標準曲線，所得線性回歸方程為A＝0.5054C－0.0479（r＝0.9998），表明 Cel濃度在10.0～100.0 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

圖3 雷公藤紅素的標準曲線

2.2.3 精密度實驗 取“2.2.2”項下10.0、50.0、100.0μg/mL的標準溶液，于1d內連續進樣5次，計算日內精密度；不同天內，每日進樣1次，連續進樣5d，計算日間精密度。日內RSD分別為1.3%、1.1%、0.6%，日間 RSD 分別為 2.3%、1.6%、0.9%，結果日內及日間精密度的RSD均在《中華人民共和國藥典》（2010版）二部附錄Ⅺ ⅩA的要求范圍內，說明日內及日間精密度良好。

2.2.4 穩定性考察 精密吸取1mL雷公藤紅素醇質體液，置于10mL容量瓶，甲醇定容，超聲15 min破乳，分別于0、2、4、6、8、12、24h進行測樣，計算RSD。結果RSD為1.1%，表明Cel標準溶液在24h內穩定。

2.3 體外透皮試驗

2.3.1 離體小鼠皮膚的制備 取18～22g的健康昆明小鼠，用脫毛劑（8%硫化鈉漿糊:硫化鈉8g，淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g，加水75mL攪拌均勻）脫去小鼠腹部毛發，邊脫邊洗，放置過夜，第二天短頸處死小鼠，剝取皮膚，除去皮下組織和脂肪，生理鹽水漂洗干凈后即用。

2.3.2 透皮吸收實驗［8］將離體小鼠皮膚固定在給藥池與接受池之間，接受液液面與皮膚真皮層面接觸；給藥池分別注入Cel醇質體、空白醇質體/Cel溶液和Cel溶液2mL，接受池中分別加入18mL透皮接受液（20%乙醇，0.5%聚山梨酯-80的 PBS液），液體恒速攪拌（400r/min），并保持恒溫37℃（±0.1℃），分別于2，4，6，8，10，12，24，48h取1 mL接受液，及時用移液槍補充同溫同體積的新鮮接受液。將取得的樣品用0.22μm的有機微孔濾膜濾過，進樣檢測，累積滲透量和滲透速率計算公式

滲透速率

式中:Cn為不同取樣點時的接受液的濃度；Ci為各取樣點時取樣液的濃度；V，Vi分別為接受池體積和取樣體積；A 為透皮擴散面積（1.77cm2）；Δt為取樣點的時間間隔。

2.3.3 接收液的選擇 選擇透皮接受液的原則是使藥物被機體吸收的環境達到“漏槽條件”，即藥物在接受液中的累積滲透量要較大。實驗中分別配制生理鹽水，V（乙醇）∶V（PEG400）∶V（生理鹽水）＝5∶2∶3，V（乙醇）∶V（TW80）∶V（PBS）＝20∶0.5∶80）及V （乙醇）∶V （PBS）＝20∶80）這四種接受液，分別測定48h時Cel醇質體在這4種接收液中的累積滲透量。其透皮結果見表1。結果表明，Cel醇質體在乙醇/TW80/PBS中的累積滲透量最大，為77.01μg/cm2，故選擇乙醇/TW80/PBS為接受液。分別如下:

累積滲透量

表1 不同接收液中48 h后Cel醇質體的累積滲透量與累積透過率（n＝3）

2.3.4 不同促滲劑對Cel醇質體透皮吸收的影響

根據相關文獻的查閱和前期考察，本實驗選擇了幾種常用的促滲劑:丙二醇、甘油、氮酮及薄荷腦，同時考慮到促滲劑的刺激性問題，將丙二醇、甘油、氮酮及薄荷腦的考察范圍分別設定為5%～15%、1%～5%、1%～3%及0.5%～1.5%，按“2.3.3”項下方法進行實驗，考察不同促滲劑對Cel醇質體體外透皮吸收的影響，實驗結果（表2）表明不同的促滲劑對Cel醇質體透皮吸收有不同的影響:當加入薄荷腦和甘油后，Cel醇質體的滲透速率減小了；而丙二醇和氮酮能促進Cel醇質體的透皮吸收，其中，丙二醇的促滲效果最明顯，且滲透速率隨著丙二醇含量的增加而增加，當丙二醇的含量為15%時，促滲作用最大，增滲倍數為1.26倍。

表2 不同促滲劑對Cel醇質體體外透皮吸收的影響（n＝3）

3 討論與結論

將Cel制備成醇質體，以便將來可能作為搽劑來治療風濕性關節炎或紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，其中累積透過量和滲透速率是判斷一種藥物是否能達到療效的重要指標。根據透皮實驗結果，薄荷腦和甘油不利于Cel醇質體的透皮吸收，可能是由于薄荷腦和甘油的加入導致了醇質體雙分子層結構的破壞，引起了藥物滲漏。丙二醇的作用機制主要是通過在角質層蓄積，增加藥物在角質層中的溶解性和分配性，從而起到促滲作用。因此可考慮丙二醇作為Cel醇質體的促滲劑。

［1］ 黃明來，馬 卓.雷公藤的研究進展［J］.化學與生物工程，2012，29（07）:1-4.

［2］ 周炎儀，黃捷儀，李靜玲，等.雷公藤制劑的用藥安全性分析［J］.臨床合理用藥雜志，2012，5（23）:120.

［3］ Yuanqiang Guo，Xian Li，Jinghui Wang，et al.A new alkaloid from the roots of Celastrus orbiculatus ［J］.Fitoterapia，2005，76（02）:273-275.

［4］ Allison AC，Cacabelos R，Lombardi VR，et al.Celastrol，apotent antioxidant and anti-inflammatory drug，as a possible treatment for Alzheimer′s disease［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2001，25（07），1 341-1 357.

［5］ Pinna GF，Fiorucci M，Reimund JM，et al.Celastrol inhibits pro-inflammatory cytokine secretion in Crohn′s disease biopsies［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，322（03）:778-786.

［6］ Godin B，Touitou E，Rubinstein E，et al.A new approach for treatment of deep skin infections by an ethosomal antibiotic preparation:an in vivo study［J］.J Antimicrob Chemother，2005，55（06）:989-994.

［7］ Touitou E，Dayan N，Bergelson L，et al.Ethosomes-novel vesicular carriers for enhanced delivery:characterization and skin penetration properties［J］.J Control Release，2000，65（03）:403–418.

［8］ 羅麗萍，王 軍，何 文.酮洛芬醇質體體外經皮滲透研究［J］.中國藥師，2012，15（09）:1 225-1 227.