熊果酸灌胃給藥大鼠體內藥代動力學研究

楊巧虹，蒙明姜，王林麗

(1. 重慶醫療器械質量檢驗中心，重慶 401147; 2. 中國人民解放軍第三軍醫大學大坪醫院藥學部，重慶 400042)

熊果酸(UA)又名烏蘇酸，為非極性五環三萜酸，系許多中藥及其復方制劑的主要成分。熊果酸具有多種生物學活性，尤其在抗腫瘤、保護肝臟、調節中樞神經系統功能、抗病毒和抗菌方面作用顯著[1-3]。目前，國內多側重于其植物化學方面的研究，而國外在其藥理學方面的研究較多。本試驗中建立了測定熊果酸血藥濃度的高效液相色譜(HPLC)法，并對灌胃后的大鼠體內藥代動力學進行了研究，現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

Agilent-1100 型高效液相色譜儀、紫外檢測器、泵及柱溫箱(美國安捷倫科技公司);AUW 120D 型電子天平(日本島津公司);XW-80A 型旋渦混合器(上海馳唐電子有限公司);TGL-16G 型臺式高速離心機(上海醫用分析儀器廠)。熊果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110742 -201220);熊果酸提取物(自制，純度大于95%);乙腈為色譜純(美國Fisher 公司)，水為二次重蒸水，其余試劑均為分析純。健康SD 大鼠，體重200 ～250 g，雌雄各半，購自四川大學實驗動物中心。試驗前適應性喂養1 周。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取熊果酸對照品約20 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀釋并定容，搖勻，即得質量濃度為200 μg/mL 的對照品貯備液，置4 ℃冰箱冷藏保存。取熊果酸提取物適量，置25 mL容量瓶中，重蒸水超聲混勻得每1 mL 含熊果酸1.0 mg 的混懸液，作為大鼠灌胃液。

2.2 血漿樣品預處理

精密量取血漿樣品0.1 mL，加入甲醇20 μL，按1 ∶1 加入10%三氯乙酸溶液0.1 mL，旋渦混勻2 min，以1.0×104r/min的轉速離心5 min，精密量取上清液20 μL，注入高效液相色譜儀進行分析。

2.3 血藥濃度測定方法的建立(HPLC 法)

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(78.5 ∶21.5);檢測波長:221 nm;柱溫:35 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL。在上述色譜條件下，測得空白血漿、空白血漿加熊果酸對照品及大鼠灌胃給藥1.5 h 后血漿樣品的色譜圖(圖1)。可見，熊果酸保留時間約為12.5 min，血漿中其他雜質不干擾熊果酸的分離和測定，滿足檢測要求。

2.3.2 方法學考察

標準曲線制備:精密吸取熊果酸對照品貯備液適量，分別用甲醇稀釋成系列質量濃度的工作溶液，各取20 μL，加入0.1 mL空白大鼠血漿中，使血漿中藥物質量濃度分別為0.05，0.10，1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00 μg/mL，按2.2 項下方法處理，記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標、血漿中藥物質量濃度(C，μg/mL)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=1.656 ×103C+9.63 ×102(r=0.999 5，加權系數1/ C2)。結果表明，熊果酸質量濃度在0.05 ～50.00 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好，定量限為0.05 μg/mL，檢測限為15 ng/mL。

圖1 高效液相色譜圖

方法回收率試驗:取空白血漿0.1 mL，分別加入20 μL 不同質量濃度的對照品溶液，得質量濃度分別為0.10，5.00，50.00 μg/mL 的含藥血漿，按2.2 項下方法處理，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 方法回收率試驗結果(n=6)

提取回收率試驗:取空白血漿0.1 mL，分別加入20 μL 不同質量濃度的對照品溶液，得質量濃度為0.10，5.00，50.00 μg/mL的3 個血漿樣品，按2.2 項下方法處理，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積。取對照品甲醇溶液，在相同條件下直接進樣，測定峰面積。以2 種方法測得的峰面積之比計算提取回收率。結果熊果酸平均提取回收率為85.36%，RSD 為6.58%(n=3)。

精密度試驗:取已知含熊果酸0.10，5.00，50.00 μg/mL 的對照品溶液，依法處理并進樣測定，以1 d 內6 次測定結果計算日內精密度，以1 周內連續3 d 測定結果計算日間精密度。結果日內精密度的RSD 分別為4.25%，3.83%，2.98%(n=6)，日間精密度的RSD 分別為11.28%，9.53%，8.79%(n=3)。

穩定性試驗:配制低、中、高(0.10，5.00，50.00 μg/mL)質量濃度的血漿樣品數份，分別于不同條件下存放不同時間后，按2.2 項下方法處理，按擬訂色譜條件進樣測定，計算熊果酸含量，考察樣品放置穩定性。結果血漿樣品室溫下放置4 h、-20 ℃冰箱中冷凍保存7 d、反復凍融3 次后測定值的RSD 值均小于12%，表明3 種條件下樣品穩定性均良好，滿足樣品分析要求。

2.4 藥代動力學參數測定

取SD 大鼠10 只，雌雄各半，試驗前一晚禁食12 h，不禁水;將熊果酸提取物混懸液按20 mg/kg 灌胃，于給藥前及給藥后0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，12.00 h時從尾靜脈取血約0.3 mL，置肝素化塑料離心管中，分離血漿，置-20 ℃冰箱中保存。按2.2 項下方法處理含藥血漿，按擬訂色譜條件測定血藥濃度。采用DAS 2.1.1 版藥動學軟件處理數據，并計算藥代動力學參數，血藥濃度-時間曲線見圖2。熊果酸的大鼠體內過程符合一室模型，主要藥代動力學參數見表2。

圖2 熊果酸均值血藥濃度-時間曲線(n=10)

表2 熊果酸灌胃的主要藥代動力學參數(n=10)

3 討論

熊果酸在體外對革蘭陽性(G+)菌、革蘭陰性(G-)菌和酵母菌均有抗菌活性，具有抗糖尿病、抗潰瘍及調節血脂的作用，同時具有抗致癌、抗促癌、誘導F9 畸胎癌細胞分化和抗血管生成作用，還具有明顯的抗氧化功能，且對中樞神經系統有明顯的安定與降溫作用[4]。

本研究結果顯示，大鼠單劑量灌胃給予20 mg/kg 熊果酸提取物后，熊果酸的體內過程符合一室模型，約1.0 h 達峰，吸收較迅速;消除半衰期為(4.421 ±1.835)h，消除較慢;中心室分布容積為(5.776 ±1.652)L/kg。目前，關于熊果酸體內過程的研究報道很少，趙國臣等[5]采用HPLC 法測定了小鼠血漿中熊果酸的質量濃度，但僅得到3 個時間點的平均血藥濃度。裴丹等[6]研究了龍柴方總萜部位中熊果酸、齊墩果酸在大鼠體內的藥代動力學，熊果酸含量為9.4%，體內過程符合二室模型，吸收迅速，體內分布快，表觀容積大，消除緩慢，血中藥物濃度長時間保持低水平，且有雙峰現象，認為可能是由于灌胃的有效部位為中藥復方提取物，而復方中的中藥配伍對熊果酸的吸收有一定影響。

本研究中，以熊果酸高純度提取物灌胃給藥，考察其在大鼠體內的運行過程，初步闡明了其體內藥代動力學過程，為將來口服制劑的處方設計和質量評價奠定了基礎。

[1] 王 鵬，張忠義，吳 忠. 熊果酸在藥用植物中的分布及藥理作用[J]. 中藥材，2000，23(11):717 -722.

[2] 楊新河，呂幫玉，毛清黎. 熊果酸的藥理研究進展[J]. 貴陽中醫學院學報，2006，28(6):52 -54.

[3] 王 濤，邵敬偉，郭養浩. 熊果酸抗腫瘤作用及其機制研究進展[J].藥物生物技術，2008，15(2):148 -151.

[4] 孟艷秋，陳 瑜，王 趲，等. 熊果酸的研究進展[J]. 中國新藥雜志，2007，16(1):25 -28.

[5] 趙國臣，朱仲玲，張春艷，等. 高效液相色譜法測定小鼠血漿中熊果酸的濃度[J]. 中國醫院藥學雜志，2007，27(12):1 782 -1 783.

[6] 裴 丹，歐陽臻，趙 明，等. 龍柴方總萜部位中熊果酸、齊墩果酸在大鼠體內的藥動學研究[J]. 中國新藥與臨床藥理，2013，24(3):267-271.