毛細管氣相色譜法測定注射用利培酮微球中有機溶劑殘留量

馬建芳，朱瀛華，任飛亮，劉 蔚，彭興盛，陳桂良

(上海市食品藥品檢驗所，上海 200131)

注射用利培酮微球(商品名恒德? )是由美國楊森公司研發生產的首個長效非典型性抗精神病藥物，結合了長效劑型和非典型抗精神病藥的優勢，可顯著改善精神分裂癥引起的陽性癥狀和陰性癥狀[1-2]，具有用藥次數少、可持續釋放藥物、血藥濃度平穩、不良反應發生率低、有效性和安全性高、患者依從性和耐受性好的優點[3]，被廣泛應用于臨床。利培酮微球制備過程中使用的有機溶劑包括乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇，在微球固化成型過程中，致密堅硬的高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物可阻礙有機溶劑的揮發，造成有機溶劑殘留[4-5]。殘留的有機溶劑會引起患者注射部位刺激或疼痛，影響藥物在體內的釋放，從而影響藥效，因此應控制利培酮微球中的殘留溶劑，以提高產品質量，保證用藥安全。2010 年版《中國藥典(二部)》中規定，乙醇和乙酸乙酯是第3 類溶劑，限度為0.5%，未對苯甲醇的限度作要求。本研究中建立了可同時測定注射用利培酮微球中的殘留溶劑乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇含量的毛細管氣相色譜法，具有操作簡單、靈敏度高、重復性好、專屬性強、快速準確的特點，可作為利培酮微球中有機溶劑殘留量檢測的質量控制方法。

1 儀器與試藥

6890A 型氣相色譜儀(美國Agilent 公司)。注射用利培酮微球(美國楊森公司，批號為DJZSW00，DKZSG00，DKZSS00);乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇、苯乙醇和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱:DB-624 型毛細管柱(94 %二甲基聚硅氧烷和6 %氰丙基苯聚硅氧烷，320 μm×30 m，1.8 μm);氫火焰離子化檢測器(FID):檢測器溫度為250 ℃，進樣口溫度為220 ℃，氦氣為載氣，采用恒流模式，流速為1.0 mL/min，氫氣流速為35 mL/min，空氣流速為350 mL /min，尾吹氣流速為25 mL /min;進樣量:3 μL;分流比:10 ∶1;分析方法:程序升溫，初始柱溫130 ℃，平衡5 min，以70 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，平衡10 min。取對照品溶液依法進樣測定，乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇的理論板數均大于5 000，各有機溶劑色譜峰完全分離，分離度均大于2.5，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

取DMF 適量，置1 000 mL 容量瓶中，加乙酸丙酯25 μL 和苯乙醇150 μL，用DMF 稀釋至刻度，搖勻，作為內標溶液，其中乙醇和乙酸乙酯以乙酸丙酯為內標，苯甲醇以苯乙醇為內標。取內標溶液適量，置100 mL 容量瓶中，精密稱取乙醇155.49 mg、乙酸乙酯50.49 mg 和苯甲醇177.54 mg，置100 mL 容量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液5 mL，置50 mL 容量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，制成乙醇155.49 μg/mL、乙酸乙酯50.49 μg/mL 和苯甲醇177.54 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。精密稱取樣品內容物100 mg，置10 mL容量瓶中，加內標溶液約7 mL，超聲10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室溫，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗:取上述5 種溶劑適量，分別置10 mL 容量瓶中，加入DMF 稀釋至刻度，搖勻，作為5 種溶劑的定位溶液。將上述定位溶液分別注入氣相色譜儀，按擬訂色譜條件依法進樣測定，結果出峰順序依次為乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇，定位溶液中各組分的保留時間與對照品溶液中各組分保留時間一致，表明專屬性較強。

線性關系考察:分別精密量取對照品貯備液0.25，0.50，1.00，2.00，2.50，5.00，6.00，7.50 mL，各置50 mL 容量瓶中，加內標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得系列質量濃度對照品溶液。按擬訂色譜條件依法進樣測定，記錄色譜圖，以各個殘留溶劑的質量濃度(C)為橫坐標、對應主峰面積與內標物峰面積的比值(Y)為縱坐標(乙醇和乙酸乙酯以乙酸丙酯為內標，苯甲醇以苯乙醇為內標)進行線性回歸，得到回歸方程和相關系數，詳見表1。

精密度試驗:取2.2 項下對照品溶液，重復進樣6 次。計算得乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇峰面積與對應內標物峰面積比值的RSD分別為2.63%，1.91%，0.94% ( n=6)，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗:分別精密量取對照品貯備液2.50，5.00，7.50 mL，各置已精密稱取注射用利培酮微球內容物500 mg 的50 mL 容量瓶中，各3 份，加內標溶液約35 mL，超聲10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室溫，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，作為低、中、高濃度供試品溶液。另精密稱取本品500 mg，置50 mL 容量瓶中，加內標溶液約35 mL，超聲10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室溫，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，作為空白對照溶液。按擬訂色譜條件依法進樣測定，計算回收率。結果見表2。

圖1 氣相色譜圖

表1 線性關系考察結果及回歸方程(μg/mL)

穩定性試驗:按2.2 項下方法制備供試品溶液，取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，6，12，24，36，48 h 時依法進樣測定。結果乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇峰面積與對應內標物峰面積比值的RSD 分別為3.43%，1.52%，1.02%(n=7)，表明供試品溶液在48 h 內穩定。

表2 乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇加樣回收試驗結果(n=9)

2.4 樣品含量測定

按2.2 項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，按擬訂色譜條件分別依法進樣測定，以內標法計算各有機溶劑殘留量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(%)

3 討論

進樣方式和溶劑選擇:微球的固化成型可能會影響制備過程中所用有機溶劑的揮發，殘留的有機溶劑可影響藥物穩定性，且增加毒副作用，故殘留的有機溶劑量不應超過2010 年版《中國藥典(二部)》的限量規定[6]。殘留溶劑測定方法中，常用的進樣方式主要有頂空進樣和直接進樣。本試驗的預試驗結果表明，采取直接進樣法時，乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇的分離度較好，各組分間不相互干擾，靈敏度高，相較頂空進樣，可避免頂空沒有完全平衡和頂空進樣等帶來的測定誤差，且頂空進樣裝置容易引起乙醇和苯甲醇的殘留，故本方法采用溶液直接進樣。直接進樣時，樣品應完全溶解于溶劑中，經試驗，利培酮微球中的主要輔料高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物可完全溶解于DMF 中，DMF 的沸點較高，很少干擾其他殘留溶劑的檢查。結果表明，采用直接進樣法，利培酮微球中的輔料及溶劑DMF 對被測溶劑及內標物均無干擾，各組分峰之間的分離度均大于2.5。

色譜柱選擇:預試驗中比較了不同極性的毛細管色譜柱的分離效果，由于5 個溶劑的極性有較大區別，HP-1 和HP-5 等非極性色譜柱和DB-WAX 等極性色譜柱的分離效果均不理想，而中等極性色譜柱DB-624 對各溶劑峰的分離效果最優，且待測組分靈敏度高。在極性差異的基礎上，考慮到各個溶劑的沸點差異，為實現各色譜峰的有效分離并盡量縮短分析時間，采用了程序升溫的方法。比較了不同的起始柱溫(120，130，140，150，160，170，180 ℃)和不同的升溫速率(40，50，60，70，80 ℃/min)條件下各溶劑峰的分離效果。結果，130 ℃保持5 min 可使低沸點的乙醇、乙酸乙酯和乙酸丙酯盡早出峰并有效分離，然后以70 ℃/min的速度升溫至240 ℃保持10 min 的程序升溫條件，可顯著縮短高沸點溶劑苯甲醇和苯乙醇的出峰時間，基線漂移范圍小，可顯著改善峰形，各溶劑峰均得到有效分離，避免微球輔料在毛細管柱中殘留的現象出現。

定量方式選擇:內標法可避免樣品處理或進樣體積誤差對結果的影響，在測定揮發性殘留溶劑時定量較準確。內標物應不干擾被測物的出峰，響應較好，為保證內標物的定量準確，內標物的保留時間應盡可能與被分析物質接近。苯甲醇的沸點顯著高于乙醇和乙酸乙酯，為保證定量準確，分別采用乙酸丙酯和苯乙醇作為乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇的內標，定量準確。結果表明，各殘留溶劑的線性關系良好，精密度和準確度高，回收率符合要求。

[1] Park EJ，Amatya S，Kim MS，et al.Long-acting injectable formulations of antipsychotic drugs for the treatment of schizophrenia[J] .Arch Pharm Res，2013，36(6):651 -659.

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[3] 王麗莉. 第一個長效非典型抗精神病藥—— 注射用利培酮微球[J].中國新藥雜志，2010，19(22):2 066 -2 068.

[4] 左志輝，王 衛. 利培酮中有機溶劑殘留的頂空毛細管氣相色譜法測定[J]. 中國醫藥工業雜志，2013，44(5):496 -498.

[5] 張 華，王 翔，王學清，等. 注射用利培酮微球的制備和體外性質評價[J]. 中國新藥雜志，2013，22(20):2 423 -2 426.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)[M]. 北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅧP 61 -65.