全反式維甲酸對腹膜透析相關性腹膜纖維化大鼠轉化生長因子β1、結締組織生長因子、α 平滑肌肌動蛋白表達的影響

李敏芝 熊燕移 史偉文 張莞靈 卓華欽

廣東省東莞市第三人民醫院腎內科，廣東東莞 523320

腹膜透析（peritoneal dialysis）是一種以人體腹膜為透析膜的透析方案， 操作時需將透析液灌注至腹腔， 并通過腹膜另一側的毛細血管網交換溶質和水分，最終清除患者體內潴留的代謝產物，同時補充機體所缺乏的相關物質[1]。腹膜透析技術具有操作簡便、血流動力學影響小、 殘余腎臟功能保護好等優勢，但也存在腹膜纖維化等相關并發癥。腹膜纖維化是腹膜透析主要并發癥之一，也是多數腹膜透析患者退出腹膜透析的主要原因[2]。 全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA） 是動物體內維生素A 代謝的中間產物，具有廣泛的生理學及藥理學效用，為分析該藥物在腹膜透析中的抗腹膜纖維化中的作用，本研究選取雄性SD 大鼠進行研究，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇40 只雄性SD 大鼠，周齡6～8 周，體重220～260 g，由山東大學動物實驗研究中心提供，動物合格證號：SCKX20140017； 所有大鼠均喂養于室溫24℃、安靜、光照12 h、濕度45%、自由進食進水的環境中，編號后隨機分為對照組、模型組、實驗1 組、實驗2組，每組各10 只。

1.2 藥品與試劑

選用慶華邦制藥有限公司生產的ATRA；選用美國Baxter 醫療用品有限公司生產的4.25%腹膜透析液； 選用武漢博士德生物工程有限公司生產的兔抗大鼠轉化生長因子-β1（TGF-β1）、結締組織生長因子（CTGF）以及α 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體；選用美國Sigma 公司生產的二甲亞砜；選用福州邁新生物技術開發有限公司生產的濃縮型DAB 顯色劑；選用立陶宛MBI 公司生產的逆轉錄試劑盒；選用京博大泰克生物基因技術有限公司生產的PCR反應緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 對照組：腹腔注射生理鹽水10 mL/d+5 mL 磷酸鹽緩沖液稀釋的二甲亞砜；模型組：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+5 mL 磷酸鹽緩沖液稀釋的二甲亞砜；實驗1 組：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+ATRA 2 mg/kg；實驗2 組：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+ATRA 5 mg/kg。 所有大鼠均藥物干預4 周，期間自由進食、飲水。

1.3.2 檢測指標 干預4 周后處死大鼠，處死前1 h 對大鼠進行腹膜平衡實驗。 局部麻醉后，向所有大鼠腹腔注入腹透液20 mL，30 min 后打開腹腔，吸取液體，稱重，計算超濾量。同時給予大鼠股動脈取血操作，血標本置于-5℃溫箱內待用。

避開注射部位取大鼠腹膜及腸系膜組織，一部分標本4%多聚甲醛固定， 一部分置于含1.5 mL Trizol的EP 管內。 選用荷蘭威圖Seleetra 全自動生化儀檢測血液樣本中的尿素、葡萄糖濃度及肝細胞生長因子（HGF）、骨形態發生蛋白-7（BMP-7）、白細胞介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子（VEGF）表達水平。將多聚甲醛固定的樣本常規石蠟包埋， 切片， 脫蠟，H2O2滅活，滴入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液，微波加熱至沸騰，冷卻，洗滌，BSA 封閉，滴入兔抗大鼠臟層腹膜組織中TGF-β1、CTGF 或α-SMA 多克隆抗體一抗，洗滌，山羊抗兔IgG 二抗，洗滌，BAD 顯示，封片，鏡檢，并采用Imageproplus 6.0 軟件進行數據提取與處理。1.3.3 觀察指標 觀察對比四組大鼠的體重變化情況、腹膜功能變化情況[超濾量（UF）、透析液尿素濃度（D）、血漿尿素濃度（Purea）、初始腹透液葡萄糖濃度（D0）、透出液葡萄糖濃度（D1）、計算D/Purea、D1/D0]、TGF-β1、CTGF、α-SMA 的表達變化情況、 各組大鼠血清細胞因子HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 的變化情況。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0 對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組實驗大鼠的一般情況變化

各組大鼠均正常進食、進水，無實驗大鼠死亡，實驗1 組和實驗2 組大鼠有不同程度的脫毛、 豎毛現象；四組實驗大鼠的體重在實驗第1 天比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；實驗第4 周，模型組大鼠體重最高，組間比較差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 四組大鼠的體重變化情況（g，±s）

表1 四組大鼠的體重變化情況（g，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與實驗1 組比較，▲P ＜0.05

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2.2 四組實驗大鼠的腹膜功能測定情況

實驗第4 周，模型組和實驗1 組的腹膜功能指標UF、D/Purea、D1/D0測定值較對照組均有不同程度的下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）；實驗2 組與對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。 見表2。

表2 四組實驗大鼠的腹膜功能測定情況（±s）

表2 四組實驗大鼠的腹膜功能測定情況（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與實驗1 組比較，▲P ＜0.05； UF：超濾量； D：透析液尿素濃度； Purea：血漿尿素濃度； D0：初始腹透液葡萄糖濃度；D1：透出液葡萄糖濃度

組別 只數 UF（mL） D/Purea D1/D0對照組模型組實驗1 組實驗2 組F 值P 值10 10 10 10 10.4±0.5 4.9±0.8*7.2±1.1*#9.8±1.3#▲18.436 0.001 0.49±0.05 0.76±0.11*0.62±0.08*#0.51±0.04#▲7.066 0.032 0.74±0.09 0.39±0.07*0.63±0.06*#0.71±0.08#▲9.707 0.016

2.3 四組實驗大鼠腹膜組織的纖維化細胞因子表達情況

與對照組比較，模型組、實驗1 組、實驗2 組的臟層腹膜組織中TGF-β1、CTGF、α-SMA 免疫組化檢測結果均發生顯著的變化，差異有統計學意義（P ＜0.05）；且實驗1 組、 實驗2 組較模型組的表達水平降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。 見表3。

表3 四組實驗大鼠腹膜組織的纖維化細胞因子表達情況（±s）

表3 四組實驗大鼠腹膜組織的纖維化細胞因子表達情況（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與實驗1 組比較，▲P ＜0.05；TGF-β1：轉化生長因子-β1；CTGF：結締組織生長因子；α-SMA：α 平滑肌肌動蛋白

組別 只數 TGF-β1 CTGF α-SMA對照組模型組實驗1 組實驗2 組F 值P 值10 10 10 10 126.7±18.4 634.9±47.2*388.5±31.9*#226.5±27.3*#▲31.723 0.001 67.8±13.9 498.5±71.3*308.5±59.1*#187.4±46.4*#▲18.749 0.001 83.9±28.5 673.5±182.7*408.2±151.4*#276.3±98.9*#▲10.083 0.005

2.4 四組實驗大鼠的血清纖維化細胞因子變化情況

模型組、實驗1 組、實驗2 組HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平均較對照組顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；實驗1 組、實驗2 組的HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平顯著低于模型組， 差異有統計學意義（P ＜0.05）。 見表4。

表4 四組實驗大鼠的血清纖維化細胞因子變化情況（ng/L，±s）

表4 四組實驗大鼠的血清纖維化細胞因子變化情況（ng/L，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05HGF：葡萄糖濃度及肝細胞生長因子；BMP-7：骨形態發生蛋白-7；IL-6：白細胞介素-6；VEGF：血管內皮生長因子

組別 只數 HGF BMP-7 IL-6 VEGF對照組模型組實驗1 組實驗2 組F 值P 值10 10 10 10 108.4±19.6 276.4±25.1*194.5±17.2*#148.5±16.6*#16.682 0.001 112.8±14.9 348.5±31.7*225.7±23.5*#183.9±27.4*#12.831 0.001 32.6±9.4 108.5±17.3*67.9±13.5*#47.8±14.7*#12.191 0.001 0.18±0.01 0.53±0.09*0.32±0.07*#0.26±0.06*#12.223 0.001

3 討論

腹膜纖維化多見于腹膜透析中晚期，其病理學表現為腹膜間皮質細胞脫落、微絨毛喪失、細胞外基質沉積、細胞間隙增大、膠原纖維排列紊亂等[3]。 間皮細胞損傷是腹膜纖維化早期病變基礎，隨著透析時間的延長，透析液內的葡萄糖將進一步抑制間皮細胞的增殖，并同時干擾細胞外基質的代謝，導致腹膜間皮細胞形態改變，最終纖維化。 纖維化的腹膜將無法繼續進行腹膜透析，這將影響患者的進一步治療[4]。 因此，如何有效地降低腹膜纖維化成為腹膜透析治療工作中的重點。

ATRA 是維甲酸的重要活性形式，可與維甲酸受體相互作用，進而調節、影響胚胎發育，對多種細胞（如腫瘤細胞、平滑肌細胞等）生殖、分化具有重要作用。 此外，ATRA 還具有抗炎及調節細胞外基質合成的功效。 近些年的研究顯示，ATRA 在動物模型中具有極高的抗纖維化及細胞增殖能力，并開始應用于治療成纖維細胞大量增殖相關皮膚疾病的防治中[5]。研究顯示，ATRA 可通過調節腎臟組織的TGF-β1表達水平來影響細胞外基質代謝，降低血小板衍生因子水平，增強系膜細胞外基質金屬蛋白酶的表達，最終延緩腎小球的硬化[6]。 為分析ATRA 對腹膜透析相關腹膜纖維化的影響， 本研究進行大鼠造模實驗發現，模型組和實驗1 組的腹膜功能指標UF、D/Purea、D1/D0測定值較對照組均有不同程度的下降， 提示腹膜透析對大鼠腹膜功能具有明顯損傷，造模成功。 本研究發現，相比照組，模型組、實驗1 組、實驗2 組的臟層腹膜組織中TGF-β1、CTGF、α-SMA 免疫組化檢測結果均發生顯著的變化（P ＜0.05），實驗1 組、實驗2組較模型組表達水平更低（P ＜0.05）。 臟層腹膜組織中TGF-β1 是臨床公認的強效致纖維化因子，參與著多種器官的纖維化過程。 TGF-β1主要由巨噬細胞、T淋巴細胞合成，具有多種生理功能，對細胞外基質的形成、血管的生成、炎癥以及組織修復等均有重要作用[7]。 動物實驗表明，大量注入TGF-β1腺病毒載體后，大鼠將出現明顯腹膜增厚、血管新生以及間質細胞增殖情況， 其腹膜功能顯著下降， 提示高表達的TGF-β1對腹膜纖維化具有重要作用[8]。CTGF 屬于CCN家族的一員，具有促細胞增殖、調節細胞外基質、促細胞黏附及趨化的能力。 CTGF 可介導TGF-β1促纖維化，是腹膜及其他臟器纖維化的重要影響因子[9]。 α-SMA 是真核細胞的骨架蛋白，參與著微絲的構成，是細胞轉化為成肌成纖維細胞的標志性蛋白。

本研究中還發現，模型組、實驗1 組、實驗2 組HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平均較對照組顯著升高（P ＜0.05），實驗1 組、實驗2 組的HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平顯著低于模型組（P ＜0.05）。HGF 是急性肝損傷動物血漿內的一種蛋白因子，對肝再生具有重要作用[10-11]。 體外實驗表明，HGF 可降低、逆轉腎間質纖維化、肝纖維化等臟器纖維化進程[12-13]。 BMP-7 是人體間充質細胞分化為骨、軟骨、肌腱、韌帶的重要誘導蛋白。 IL-6 是炎癥因子的一種，可由間皮細胞或浸潤的炎癥細胞合成， 炎癥是纖維化的重要病理誘因之一[14-16]。 VEGF 具有促腹膜血管生成能力， 對腹膜纖維化病理生理過程具有重要促進作用。

綜上所述，TGF-β1、CTGF、α-SMA 等細胞因子是腹膜透析相關腹膜纖維化的重要影響因子，而ATRA可通過調節大鼠TGF-β1、CTGF、α-SMA 等細胞因子的表達來抑制腹膜纖維化過程，并維持大鼠腹膜功能。

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