槐米提取物的制備工藝及其紫外吸收特性考察

史方超 喬立業 陸 崟 蘇 華 任海祥南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇南京 210002

槐米為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的花蕾，已有2000 多年藥用歷史，《神農本草經》還將其列為上品。 槐米中含有蘆丁、槲皮素、三萜皂苷、多糖黏液質等成分，蘆丁為主要成分[1]。 蘆丁是天然的黃酮類化合物，維生素P 的主要組分之一[2]。近年來有不少國內外醫藥工作者對蘆丁的藥理作用進行過研究， 槐米中蘆丁的含量高達12%～20%[3]。 研究表明，蘆丁有抗癌防癌、鎮痛、降血壓、預防中風、抗菌抗病毒、抗衰老、抗炎抗過敏、抗自由基及抗氧化等多種作用[4-5]。 蘆丁能增強毛細管的韌性，增強血管壁的彈性，對高血壓患者具有防止腦血管破裂功效，具有較強的藥理作用[6]。 本研究采用超聲波提取法提取槐米，以多指標考察提取成分，并以槐米中蘆丁含量為考察指標進一步研究，最后確定了槐米主要防曬成分蘆丁的提取工藝，為槐米蘆丁在工業化生產及化妝品防曬霜中的開發提供了實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀，KQ5200DE 型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），UV-2100型紫外-分光光度計（島津儀器上海有限公司），AE240電子分析天平（METTLER TOLEDO 精密儀器有限公司），FA1204S 分析天平（上海市精密儀器有限公司），密封式搖擺型粉碎機CF-6A（江蘇金壇市醫療藥材器械廠）。

1.2 試藥

槐米（批號：121010，南京海源藥事服務有限公司中藥飲片廠）， 經南京軍區南京總醫院王曙東主任藥師鑒定為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾。蘆丁對照品（批號：100080-200707，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 槐米的提取

將槐米粉碎后， 取0.5 g 槐米細粉置50 mL 容量瓶中，加入15 mL 70%乙醇，在65℃下超聲提取30 min。超聲后過濾并定容至50 mL 容量瓶中，重復提取兩次，合并提取液，精密吸取提取液1 mL，定容到25 mL 容量瓶中制成供試品液。

2.2 槐米提取液的紫外吸收

取槐米供試品液1 mL，加70%乙醇定容至25 mL容量瓶中，以70%乙醇為空白，在200～400 nm 范圍內進行紫外掃描，確定各波長下的吸光度值。 分別計算UVC（200～280 nm）、UVB（280～320 nm）、UVA（320～400 nm）各區間平均吸光度值。

2.3 蘆丁的含量測定[7]

2.3.1 最大吸收波長的選擇 精取一定量的對照品于50 mL 量瓶中，用甲醇定容，進行紫外掃描，測得最大吸收波長為257 nm。 見圖1。

圖1 對照品蘆丁的紫外吸收圖

2.3.2 色譜條件的選擇[8-9]色譜柱：Lichrospher 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%冰醋酸（45∶55），流速1 mL/min，檢測波長257 nm，柱溫30℃。樣品溶液過0.45 μm 微孔濾膜，進樣10 μL。 見圖2。

圖2 蘆丁HPLC 圖

2.3.3 對照品儲備液的制備 精密稱取于110℃干燥至恒重的蘆丁對照品20.48 mg，加甲醇定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，作為對照品儲備液（含蘆丁0.4096 mg/mL）。

2.3.4 供試品溶液的制備 樣品溶液的制備：精密稱取本品（藥材）0.03 g，置50 mL 容量瓶中，加70%乙醇適量，65℃下超聲提取30 min 使溶解，取出放冷至室溫，70%乙醇定容至刻度，搖勻，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾，棄初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.3.3”項下蘆丁對照品儲備液各0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL， 置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。 經0.45 μm 的微孔濾膜濾過后，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀中，按“2.3.2”項下方法進行測定，以對照品的進樣量為橫坐標（X），對照品的峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y=18 630X+9.9292（r＝1，n＝5）。 結果表明蘆丁進樣量在0.02048～0.32768 mg/mL 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.6 精密度試驗 取“2.3.3”項下蘆丁對照品溶液，按“2.3.2”項下液相色譜條件，連續進樣5 次，蘆丁峰面積的RSD 為0.15%（n＝5）。

2.3.7 重復性試驗 分別精密稱定本品5 份， 按照“2.3.4”項下供試品溶液制備得到5 份供試品溶液，分別精密吸取10 μL 注入液相色譜儀中，記錄蘆丁峰面積，以外標法計算各供試品中蘆丁的含量，結果平均含量為207.98 mg/g，RSD 為0.8%（n＝5）。

2.3.8 穩定性試驗 照“2.3.4”項下方法制備供試品溶液，采用“2.3.2”項下液相色譜條件，分別在0、2、4、6、8 h 進樣10 μL，記錄蘆丁峰面積，測定供試品標示含量，RSD 為0.23%， 表明供試品溶液在8 h 內穩定性良好，符合實驗需要。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取槐米細粉 （60 目）0.015 g，共9 份，分別置9 個50 mL 量瓶中，分別精密加入“2.3.3”項下的蘆丁對照品溶液作為儲備液。儲備液4、5、6 mL 各3 份， 制成低、 中、 高濃度三組，按“2.3.4”項下的方法制備即得。分別精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，計算各供試品含量，結果平均加樣回收率為98.15%，RSD 為2.25%（n=9）。

2.4 單因素考察

2.4.1 紫外吸收的單因素考察 以乙醇為提取溶劑，分別從乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、料液比、提取次數方面對槐米提取液的吸光度值的變化進行考察。見圖3。

圖3 紫外吸收的單因素實驗結果

由圖3A 可見，在不同乙醇濃度下，槐米提取液在各紫外區間的平均吸光度值先升高后降低，在乙醇60%濃度下為最高， 紫外輻射UVR （UVR=UVA+UVB+UVC）=1.741（n=3）；圖3B 顯示，在不同的料液比條件下，槐米提取液的紫外平均吸光度值先升高后降低，在料液比1∶30 條件下，紫外平均吸光度值相對最高，UVR=1.576（n=3）；圖3C 表明，在不同的超聲溫度條件下，槐米提取液的紫外平均吸光度值先升高后略有降低， 在50℃時紫外平均吸光度值最高，UVR=1.973（n=3）；圖3D 表明，各超聲時間下除10 min 外其他條件下紫外平均吸光度值基本差不多；圖3E 表明，提取次數實驗中， 槐米提取液在各區間的紫外平均吸光度值基本一樣， 提取5次時紫外平均吸光度值最高，UVR=1.658（n=3）。

2.4.2 蘆丁含量的單因素考察 分別從乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度、提取次數方面對槐米提取液中蘆丁含量的變化進行考察。 見圖4。

由圖4A 可見， 蘆丁的提取率先升高后降低，以60%乙醇濃度時為最高， 蘆丁含量為188.1 mg/g （n=3），因此選擇60%乙醇濃度。隨著溶劑量的增加，在料液比1∶10～1∶30 之間蘆丁的含量逐漸升高。 圖4B 顯示，當溶劑量超過30 倍量時，蘆丁含量隨著溶劑量的增加反而降低。 故選擇料液比1∶30，此時蘆丁含量最高，為189.0 mg/g（n=3）。 圖4C 表明，蘆丁在30～50℃的含量隨溫度的升高而增加， 而當溫度進一步升高時，易引起蘆丁結構的破壞和生物活性喪失，其含量反而略有下降。因此，選擇超聲溫度50℃，蘆丁含量為184.6 mg/g（n=3）。 由圖4D 可見，在超聲時間30 min左右蘆丁的提取率最高。 超過30 min 后蘆丁含量反而下降，超聲時間過長可能使蘆丁受到破壞。因此，選擇超聲時間為30 min，蘆丁含量為191.1 mg/g（n=3）。由圖4E 可見，提取2 次時蘆丁的提取率最高，蘆丁含量為177.1 mg/g（n=3）。

提取時溫度越高，分子熱運動越激烈，使溶劑與提取物分子間的傳遞加速， 有利于目標產物的溶出，有效成分的提取率就越高， 而超聲時間決定生產周期，因此，它是工藝研究中一個十分重要的考察因素。由圖4E 所示，在提取次數單因素試驗中表明，多次提取會造成蘆丁氧化從而使得蘆丁含量下降，而且使得實驗步驟過于繁瑣，因此選擇提取2 次為最佳。

2.5 正交試驗考察

根據“2.4”項下的結果，超聲波提取法中主要影響因素為乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）4 個因素。以四因素三水平建立因素水平表，并依此設計L9（34）正交表進行正交試驗，見表1、2。

由表3 槐米紫外吸收方差分析所示，從方差比的大小可知，D＞A＞B＞C，影響槐米紫外吸收的主次因素順序為超聲溫度＞乙醇濃度＞料液比＞超聲時間， 超聲溫度差異有統計學意義（P ＜0.05），最佳提取條件為A3B2C2D3。由表4 蘆丁的正交試驗方差分析表明，從方差比的大小可知，D＞A＞B＞C，影響槐米中蘆丁含量的主次因素順序為超聲溫度＞乙醇濃度＞料液比＞超聲時間，而其中超聲溫度、乙醇濃度和料液比差異均有統計學意義（P ＜0.05），最佳提取條件為A3B2C2D3。 綜合上述結果，最佳提取條件為A3B2C2D3。

表1 提取蘆丁影響因素與水平

圖4 蘆丁含量的單因素實驗結果

表2 蘆丁的正交試驗結果

2.6 最佳工藝驗證試驗考察

取槐米0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，加入70%乙醇15 mL，在65℃下超聲提取30 min，重復提取2 次。 在最佳工藝條件下重復實驗3 次，分別測定槐米提取液的紫外吸收度、蘆丁含量，取平均值，由表5 結果可知，槐米藥材中蘆丁的UVR 達到1.834，蘆丁含量為198.63 mg/g ，該提取工藝穩定，提取率高。

表3 槐米紫外吸收方差分析

表4 蘆丁提取方差分析

表5 優選提取工藝驗證實驗結果

3 討論

3.1 槐米提取方法

中藥槐米的提取方法一般有醇提法、 熱水提取法、堿提酸沉法、超聲波提取法等[10-11]。 超聲波法具有提取時間短、操作簡單、能避免高溫對提取成分的影響等優點，最終采用超聲波提取法制備槐米提取液。

3.2 槐米蘆丁的防曬作用

槐米蘆丁能增強和恢復血管壁的彈性，降低毛細血管的通透性，增強毛細血管的韌性，對皮膚有著較強的抗自由基氧化和抗輻射作用，對紫外線具有很強的吸收作用， 有明顯的清除細胞活性氧自由基的作用，是目前較為理想的一種天然廣譜防曬劑[12]。

3.3 太陽光中各波段紫外線作用

太陽光中的UVA 為長波紫外線，有強穿透力，能使皮膚干燥，加速表皮細胞中黑色素形成，使得膚色變黑[13]，這也是誘發皮膚癌的重要原因之一。UVB 為中波紫外線，中等穿透力，但對皮膚作用力最強，能使皮膚表皮細胞中的核酸或蛋白質變性， 長期或過量照射會使皮膚曬黑，并引起紅腫和脫皮。 UVC 短波紫外線對皮膚的傷害最大，短時間內照射就能灼傷皮膚，長時間或高強度的照射還會誘發皮膚癌[14-15]。所以本研究在對槐米提取物的紫外各區間進行紫外吸收度的考察。

3.4 單因素考察試驗

單因素考察試驗表明，槐米提取液的紫外吸收值大小與蘆丁含量高低成正比，這也說明槐米提取液的紫外吸收與其蘆丁的含量有著密切的關系。 因此，筆者對它們同時進行了正交試驗考察[16]。 紫外吸收方差分析結果表明，溫度有顯著差異。 蘆丁提取方差分析結果顯示，乙醇濃度、料液比和溫度均有顯著差異，兩者最佳提取條件一致，這也表明了蘆丁含量是考察槐米提取液紫外吸收能力的重要指標。最終選擇優化條件為：稱取適量槐米細粉，加入30 倍量的70%乙醇，超聲溫度65℃，超聲30 min，重復提取2 次。 提取的蘆丁含量可達198.63 mg/g。

本研究對槐米防曬成分蘆丁的紫外吸收及其提取工藝進行了詳細研究，對開發有關槐米防曬產品提供了實驗依據，將會在今后研制防曬中藥復方劑型的實驗中進一步研究。

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