細胞因子信號轉導抑制劑3在大鼠靜脈移植物中的表達及意義

黃進啟 姚元波▲ 向 水 蔡彥力 鄭 勇 劉金平 .湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院心胸外科，湖北恩施 445000；.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心血管外科，湖北 武漢 4300

冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass graft，CABG） 后靜脈移植物再狹窄嚴重影響其遠期預后[1]。研究表明靜脈移植物再狹窄的病理過程是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）遷移并增殖引起中層增厚和內膜增生，最終導致血管重構和管腔狹窄，其啟動和加速進展的關鍵和核心因素是炎癥細胞因子介導的“瀑布樣”級聯放大的炎性反應[2-4]。大多數細胞因子通過janus 激酶/信號轉導與轉錄激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路發揮生物學效應。 研究表明，JAK2/STAT3 在VSMC 從靜止收縮表型向合成分泌表型轉換及遷移增殖等病理過程中發揮關鍵作用[5]，而細胞因子信號轉導抑制劑3（SOCS3）是JAK2/STAT3 信號通路的經典及特異性負反饋抑制劑[6]。 研究表明，SOCS3 通過抑制JAK2/STAT3 信號通路的下游關鍵轉錄子STAT3 激活及其磷酸化在多種炎癥相關性疾病、癌癥及自身免疫性疾病的發生和進展中發揮重要調節作用[7-10]。 然而SOCS3 在靜脈移植物再狹窄的早期病理過程中表達是否異常及可能的相關機制，目前不清楚。 本實驗借助大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型和體外培養的血管平滑肌細胞增殖模型，檢測大鼠靜脈移植物早期病變過程中的相關炎癥細胞因子、STAT3 及SOCS3 的表達情況，初步探討SOCS3在靜脈移植物再狹窄過程中的可能作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

36 只雄性健康SD 大鼠（2～3 月齡大，體重300～330 g） 購買于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心（合格證號：00018829，00018364）。 大鼠SOCS3 重組腺病毒pYrAd-rSOCS3 及對照病毒pYrAd-GFP 由武漢巴菲爾生物技術有限公司合成，1640 和DMEM培養液、胎牛血清購自美國Gibico 公司。 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（50 μg，400-20）購自Sigma 公司，一抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（AB-P-R-001）購于杭州賢至生物科技有限公司， 一抗SATA3（NBP1-19206）、SOCS3（NB600-1075）、磷酸化的信號轉導與轉錄激活因子 （P-STAT3）（NBP1-74611）、單核細胞趨化蛋白1 （MCP-1）（NBP1-07034）、 白介素1β （IL-1β）（NB110-57113）、 細胞間黏附分子1 （ICAM-1）（NB500-318）購自美國Novus 公司，一抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）（SC-1350）、白介素6（IL-6）（SC-1265）購自美國Santa Cruz 公司。 PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。顯微手術器械包及縫線購自上海浦東金環醫療用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及取材 將36 只雄性SD 大鼠隨機分成兩組，對照組和實驗組，各18 只。實驗組采用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，去除頸部毛發，行頸部正中切口。 全身肝素化（150 U/kg，皮下注射）后游離右側頸外靜脈及頸總動脈，切取2 cm 長的靜脈于肝素鹽水中保存備用。于頸總動脈中段切除5 mm，采用標準顯微外科技術， 用11-0 尼龍線將大鼠頸外靜脈遠近端顛倒翻轉間斷縫合8-10 針端吻合于頸總動脈上，開放后遠端動脈搏動明顯視為血流通暢，吻合成功。對照組行假手術，只游離頸外靜脈和頸總動脈。術后常規喂養，分別于術后第1、3、7 天取出移植靜脈，對照組取出相應長度的頸外靜脈，每個時間點6 只。 取出的靜脈立即分成兩等份置入液氮中保存備用。

1.2.2 細胞培養及轉染 采用差異組織貼塊法分離培養大鼠胸主動脈原代VSMC，α-肌動蛋白（α-actin）免疫熒光法鑒定VSMC， 第3～8 代細胞用于實驗。TCID50 法 測 定pYrAd-rSOCS3 及pYrAd-GFP 滴 度均為2×1010pfu/mL。 按感染復數40 感染VSMC，感染效率在95%以上。制備細胞懸液，調整細胞濃度，以3×105個細胞/孔加入24 孔板中，每組6 孔，加入無血清DMEM 培養基，37℃、5%CO2培養24 h 同步化細胞，換為10%胎牛血清（FBS）DMEM 培養基。 實驗組分為bFGF 組、bFGF+pYrAd-GFP 組、bFGF+pYrAd-rSOCS3組。 對照組不加刺激因子，bFGF 組只加50 ng/mL 濃度的bFGF 刺激，bFGF+pYrAd-GFP 組和bFGF+pYrAd-rSOCS3 組分別滴加復數為40 的pYrAd-GFPp 及YrAd-rSOCS3 預孵育2 h 后，再加bFGF 刺激，37℃、5%CO2繼續培養24 h。 收集細胞。

1.2.3 Real time-PCR 檢測IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、SOCS3 mRNA 表達 從液氮罐中取出1 份移植靜脈，轉入另一離心管中，立即碾碎，收集細胞，分別加入1 mL Trizol。 按照試劑盒說明書步驟依次加入氯仿、異丙醇提取總RNA，最后用4℃無水乙醇清洗3 次，室溫放置10 min 晾干，溶于20 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。 取少量樣本用分光光度計測定并計算出RNA 濃度。 取各樣本總RNA 5 μg，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書步驟將RNA 逆轉錄成cDNA，反應條件為42℃60 min，95℃5 min。 反應體系總量為20 μL。PCR 擴增：引物序列設計見表1。 反應體系總量為20 μL，組成如下：10 倍稀釋的cDNA 4 μL，水5.2 μL，SYBR Green/Fluroescein qPCR Master Mix（2×）（Invitrogen）10 μL， 上下游引物各0.4 μL。 置入Eco real time-PCR 儀。 反應條件：95℃預變性5 min，95°C 30 s，60℃30 s，72℃延伸10 min，循環40 周。 使用比較閾值法來測定目的基因的相對表達量，即實驗組目的基因的表達相對于對照組的倍數，記作2－△△Ct；-△△Ct=（Ct 目的基因-Ct 管家基因） 實驗組-（Ct 目的基因-Ct 管家基因） 對照組，Ct 是熱循環儀檢測到反應體系中熒光信號的臨界循環數值。

表1 引物序列

1.2.4 Wertern blotting 檢 測IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3、P-STAT3、SOCS3蛋白表達 從液氮罐中取出另一份移植靜脈放入EP管中，收集細胞，均立即置于冰上，移液器分別滴加細胞裂解液150 μL 和蛋白酶抑制劑4 μL，靜置30 min，4℃、10 000 r/min 離心5 min，提取上清。 上清液中包含提取的總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。 取樣品蛋白40 μg 依次進行電泳和濕轉， 用濃度為5%的脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h。 分別滴加不同比例稀釋過的相應鼠抗多克隆抗體磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（1∶800）、IL-6（1∶400）、MCP-1（1∶1200）、TNF-α（1∶800）、IL-1β（1∶2500）、ICAM-1（1∶800）、STAT3（1∶800）、PSTAT3（P Ser727，1∶800）及SOCS3（1∶800），4℃冰箱中過夜孵育，TBST 緩沖液沖洗硝酸纖維素膜10 min×3次。 滴加稀釋度為1∶2000 的驢抗羊二抗辣根過氧化物酶（HRP），室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜10 min×3 次。按照ECL 發光試劑盒說明書要求在暗室內發光曝光。應用圖像分析處理軟件Glyo Bandscan 4.3 分析相應的目的蛋白和內參電泳條帶的灰度值，目的蛋白相對表達水平等于目的蛋白條帶灰度值與樣本GAPDH灰度值的比值。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0 統計軟件處理數據， 計量資料數據均以均數±標準差（±s）表示，組間比較運用單因素ANVOA 分析及Student-Newman-keuls t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 移植靜脈mRNA、蛋白表達

取材時檢查發現，實驗組所有的移植靜脈內血流均通暢， 術后1 周時移植靜脈內膜均有不同程度增生， 說明成功建立大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型。Real time-PCR 和Wertern blotting 檢測移植靜脈中的mRNA 和蛋白表達水平，結果表明，與對照組比較，實驗組移植靜脈中的IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3（僅檢測蛋白）、P-STAT3（僅檢測蛋白）、SOCS3 mRNA 和蛋白表達水平均在術后1 周內均有明顯升高，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2、3。

2.2 VSMC 中的mRNA 和蛋白表達水平

Real time-PCR 和Western blotting 檢測VSMC 中各細胞因子的mRNA 和蛋白表達水平，結果表明，與對照組比較，bFGF 組中上述指標mRNA 和蛋白表達明顯上調 （P ＜0.05 或P ＜0.01）； 與bFGF 組比較，bFGF+pYrAd-rSOCS3 組中SOCS3 的mRNA 和蛋白表達進一步上調（P ＜0.01、P ＜0.05），而IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1 的mRNA 和蛋白表達以及STAT3、P-STAT3 蛋白表達明顯下調，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。bFGF 組與bFGF+pYrAd-GFP組比較，上述指標mRNA 和蛋白表達差異無統計學意義（P ＞0.05）。 見表4、5。

3 討論

3.1 VSMC 受bFGF 刺激后炎癥細胞因子的變化

CABG 術后自體大隱靜脈再狹窄的病理過程主要包括早期血栓形成、中期內膜增生和晚期粥樣硬化。炎性反應是其始動促發因素并成級聯放大始終貫穿于整個病理過程中[2]。 急性炎性反應可在大隱靜脈吻合到升主動脈和冠狀動脈間后數小時即出現并持續到數周。 從獲取大隱靜脈時的牽拉、缺血缺氧到置身于動脈環境中后受到高速動脈血流的沖刷及剪切應力的作用均可導致內皮細胞受損及功能失調。內皮屏障功能完整性的破壞及內膜下的裸露可招募并激活血小板、白細胞及巨噬細胞并形成血栓。 這些表型轉換及功能失調的內皮細胞、血小板、白細胞及巨噬細胞分泌大量的細胞因子、生長因子、趨化因子及黏附分子等炎癥介質產生急性炎性反應。 炎癥因子促使VSMC 從靜止收縮表型轉換為合成分泌表型，同時合成分泌大量具有促炎活性的介質促使炎性反應呈“瀑布樣”級聯放大。 表型改變的VSMC 即從中層遷移至內膜并增殖[3-4]，細胞外基質降解并沉積，最終引起內膜增生、粥樣硬化等血管重構，導致管腔狹窄和閉塞。本研究表明，在大鼠自體頸外靜脈移植到頸總動脈術后1 周的早期階段， 移植物中的炎癥細胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1 明顯表達上調， 說明出現明顯的急性炎性反應。 體外實驗結果也表明，VSMC 受到bFGF 刺激后， 其分泌上述炎癥細胞因子明顯增加。

表2 實驗組移植靜脈mRNA 表達（±s，n=6）

表2 實驗組移植靜脈mRNA 表達（±s，n=6）

注：對照組結果均為（1.00±0.00）；與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細胞間黏附分子1；SOCS3：細胞因子信號轉導抑制劑3

時間 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 SOCS3第1 天第3 天第7 天2.01±0.41*2.79±0.24**3.60±0.51**2.03±0.40*2.55±0.45**3.69±0.51**2.08±0.38*2.91±0.51**4.86±0.74**1.60±0.28 1.87±0.30*2.73±0.52**1.42±0.32 1.74±0.38*1.97±0.35*1.21±0.18 1.58±0.26 1.93±0.38*

表3 兩組移植靜脈蛋白表達（±s，n=6）

表3 兩組移植靜脈蛋白表達（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細胞間黏附分子1；STAT3：信號轉導與轉錄激活因子；P-STAT3：磷酸化的信號轉導與轉錄激活因子；SOCS3：細胞因子信號轉導抑制劑3

組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 STAT3 P-STAT3 SOCS3對照組第1 天第3 天第7 天實驗組第1 天第3 天第7 天0.30±0.07 0.25±0.04 0.35±0.05 0.74±0.13 0.62±0.12 0.85±0.17 0.33±0.08 0.41±0.11 0.29±0.07 0.22±0.03 0.27±0.04 0.19±0.04 0.17±0.02 0.15±0.03 0.21±0.02 0.24±0.06 0.30±0.07 0.21±0.05 0.32±0.04 0.28±0.05 0.37±0.10 0.37±0.08 0.42±0.12 0.30±0.10 1.11±0.26**1.63±0.35**1.52±0.37**1.23±0.27 1.46±0.25*1.90±0.31*1.11±0.24**1.51±0.27**1.66±0.30**0.53±0.16 0.58±0.15*0.74±0.17**0.65±0.12**1.02±0.39**1.02±0.18**1.14±0.27**1.35±0.31**1.50±0.36**0.92±0.27**1.60±0.37**1.54±0.39**1.14±0.21**0.82±0.18*0.75±0.17*

表4 VSMC 中的mRNA 表達水平（±s，n=3）

表4 VSMC 中的mRNA 表達水平（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與bFGF 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細胞間黏附分子1；SOGS3：細胞因子信號轉導抑制劑3

組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 SOCS3對照組bFGF 組bFGF+pYrAd-GFP 組bFGF+pYrAd-rSOCS3 組1.00±0.00 1.57±0.31*1.56±0.28 1.28±0.25△1.00±0.00 2.08±0.37**2.14±0.17 1.17±0.23△1.00±0.00 3.06±0.52**3.28±0.61 1.37±0.23△△1.00±0.00 1.71±0.19*1.73±0.34 1.48±0.21△1.00±0.00 2.10±0.27**2.09±0.35 1.34±0.21△1.00±0.00 2.37±0.24**2.31±0.31 5.47±1.03△△

表5 VSMC 中的蛋白表達水平（±s，n=3）

表5 VSMC 中的蛋白表達水平（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.01；與bFGF 組比較，△P ＜0.05；IL-6：白介素6；MCP-1：單核細胞趨化蛋白1；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白介素1β；ICAM-1：細胞間黏附分子1；STAT3：信號轉導與轉錄激活因子；P-STAT3：磷酸化的信號轉導與轉錄激活因子；SOCS3：細胞因子信號轉導抑制劑3

組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 STAT3 P-STAT3 SOCS3對照組bFGF 組bFGF+pYrAd-GFP 組bFGF+pYrAd-rSOCS3 組1.00±0.23 2.36±0.48*2.10±0.42 1.68±0.39△0.83±0.19 1.66±0.43*1.67±0.42 1.25±0.21△0.64±0.15 1.54±0.31*1.65±0.30 1.20±0.24△0.67±0.15 1.49±0.35*1.55±0.36 1.00±0.24△0.61±0.11 1.41±0.28*1.31±0.30 0.99±0.21△0.56±0.17 1.30±0.27*1.17±0.22 0.77±0.13△0.79±0.21 1.74±0.36*1.72±0.37 1.18±0.36△0.87±0.24 1.28±0.32*1.27±0.35 1.79±0.38△

3.2 JAK/STAT 信號通路在靜脈移植物狹窄早期炎性反應中的作用

JAK/STAT 信號通路是一條將信號從細胞膜轉導進入細胞核的經典信號通路，在信號通路中具有代表性，通過受體與酪氨酸激酶結合，激活信號轉導因子與轉錄活化因子并進入細胞核，啟動靶基因表達途徑發揮功能，為大多數細胞因子共用。 對機體多種細胞的增殖和凋亡、神經和胚胎發育以及免疫反應發揮復雜而精細的調控作用[11-12]。 JAK/STAT 家族包括4 個JAK和7 個STAT 成員，研究表明，其中JAK2/STAT3是調控VSMC 表型轉換及遷移增殖的一條重要信號通路[6]。本實驗結果也表明，術后1 周內的移植靜脈中STAT3 及P-STAT3 表達明顯上調。 說明在靜脈移植物狹窄的早期炎性反應中， 存在STAT3 的過度激活及其磷酸化，JAK2/STAT3 信號通路發揮了重要作用。

3.3 SOCS3 在靜脈移植物再狹窄病變中的調節作用

SOCS 蛋白既是轉錄子STAT 的靶基因，反過來，表達的SOCS 蛋白通過與STAT 競爭結合停泊位點又抑制其激活及磷酸化， 因此SOCS 是JAK/STAT 信號通路的經典負反饋抑制劑，在細胞因子表達及生物學效應中發揮精細調節平衡作用。 SOCS 家族包括CIS和SOCS1-7 蛋白， 分別由8 個不同的細胞因子誘導生成，其中SOCS3 是目前研究最多、功能最清楚和作用最強的成員。SOCS3 N 末端的激酶抑制區結構域對JAK2 的激酶區具有相對更高的親和力[13]，而SOCS3對激活STAT3 的受體又具有特異性更高的結合力，所以，SOCS3 對JAK2/STAT3 信號通路的負向調節有相對更高的特異性。 SOCS3 通過負反饋抑制JAK2/STAT3 信號通路下游的關鍵轉錄因子STAT3 的激活及其絲氨酸和酪氨酸磷酸化， 從而阻止其進入細胞核，在精細平衡免疫應答進程和調節機體多種細胞的發育、分化、增殖及凋亡過程中發揮重要作用。研究表明，SOCS3 甲基化基因沉默或表達上調在多種炎癥相關性疾病、癌癥及自身免疫性疾病的發生發展中起到重要作用[14-17]。 在人動脈粥樣斑塊中的平滑肌細胞和巨噬細胞中檢測到SOCS3 表達上調，在ApoE-/-小鼠動物模型中也得到相同結果。利用腺病毒載體SOCS3基因轉染等基因操控技術誘導其過表達可抑制單核巨噬細胞、內皮細胞及VSMC 的分化增殖及合成分泌炎癥細胞因子。 相反， 應用寡核苷酸探針技術下調SOCS3 表達可加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進程，加重動脈硬化程度[10]。 在肝炎和肝癌患者的肝細胞中檢測到SOCS3 mRNA 和蛋白表達水平下調， 同時存在STAT3 表達上調。 通過肝細胞SOCS3 條件性基因敲除或甲基化基因沉默可加使小鼠肝癌的進展加速和程度加重，相反，利用腺病毒轉染誘導SOCS3 過表達可抑制肝癌細胞的分化增殖及生長[18-20]。 SOCS3 基因敲除小鼠在胚胎期死亡。 造血干細胞SOCS3 基因條件性敲除小鼠會在成年期表現出心臟、肝臟、腎臟及肺等多個重要器官嚴重的中性粒細胞浸潤，出現嚴重的炎性反應而死亡[14]。 實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）存在Th17/Treg 細胞平衡失調及Th17 細胞極化、高表達MHCⅡ類分子和CD86，體外誘導DC 細胞過表達SOCS3 后再過繼性輸注到野生型小鼠后顯著抑制EAE 的進程和病變程度[16]。 本實驗發現，在靜脈移植物再狹窄的早期病理過程中存在SOCS3 表達上調，但仍不足以抑制過度激活的JAK2/STAT3 信號通路。 體外通過攜帶大鼠SOCS3 基因重組腺病毒轉染VSMC，誘導其過表達SOCS3，明顯下調STAT3、PSTAT3 及炎癥細胞因子的表達， 說明SOCS3 通過抑制STAT3 的激活及進一步磷酸化可能在靜脈移植物再狹窄病變過程中發揮有益的負反饋調節作用。 那么， 利用基因操控技術誘導體內移植靜脈過表達SOCS3 能否阻斷或減慢靜脈移植物再狹窄的進程，還需進一步研究證實。

總之， 本實驗研究表明SOCS3 在靜脈移植物再狹窄病變中可能發揮負向調節作用，可為防治靜脈移植物再狹窄提供一種新思路，采取措施啟動炎性反應的內源性生理性負向調節子SOCS3 的功能可能是治療靜脈移植物再狹窄的一種新策略。

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