正交試驗優選苦石蓮膠囊乙醇提取工藝

唐炳蘭 莫單丹 劉振杰 袁經權 周小雷 繆劍華廣西藥用植物研究所天然藥物化學組分研究室，廣西南寧 530001

苦石蓮膠囊是廣西藥用植物研究所根據民間驗方自制的單方制劑，具有消炎、抗菌、抗病毒、護肝等功效[1-3]，常用于感冒和肝炎的防治。 苦石蓮系豆科云實屬植物喙莢云實（南蛇簕）Caesalpinia minax Hance的種子，性涼，味苦，有清熱解毒、化濕、散瘀止痛之功效，主治風熱感冒、痢疾、淋濁、癰腫、瘡癬、跌打損傷、毒蛇咬傷等，為瑤藥經典老班藥中“七十二風”中的南蛇風[4-5]。 化學成分主要有二萜類、黃酮類、揮發油成分、植物甾醇類，現代藥理研究表明其中所含的二萜類化合物具有抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，是其發揮藥效的重要物質基礎[6]。 本研究前期對苦石蓮的化學成分做了系統研究，發現其富含卡山烷二萜類化合物Neocaesalpin L，且藥理研究發現Neocaesalpin L有較好的抗流感病毒和抗瘧疾活性，可能是苦石蓮活性物質之一。 本試驗采用L9（34）正交試驗法，以Neocaesalpin L 化合物為評價指標，優選苦石蓮膠囊的提取工藝參數，從而為實際生產提供實驗數據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司， 含柱溫箱， 標準自動進樣器，DAD 陣列檢測器，Agilent Chemstation 化學工作站），KQ-5200 型數控超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司），電子分析天平（CP2250D，Sartorius），101-1 型電熱鼓風干燥箱（上海滬南科學儀器聯營廠），W201 型恒溫浴鍋（上海申生科技有限公司），高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

Neocaesalpin L 對照品（自制，經NMR、HPLC 測定，純度＞98%）；苦石蓮（購自民間瑤醫），經廣西藥用植物園藥用資源保護與遺傳改良中心趙以民博士鑒定為豆科云實屬植物喙莢云實Caesalpinia minax Hance 的干燥種子；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 Neocaesalpin L 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：伊力特ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.5%磷酸水進行梯度洗脫（乙腈在0～25 min 由20%→50%，26～30 min 由50%→20%）；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；理論塔板數按Neocaesalpin L 峰計算應不低于5000。

2.1.2 對照品溶液的制備和線性關系

精密稱取Neocaesalpin L 對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.243 mg 的溶液，即得。 分別精密吸取對照品溶液6、8、10、12、14、16 μL 注入高效液相色譜儀，測定峰面積。 以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標進行回歸，得標準曲線方程：Y=18.4X+388（r= 0.9996）。 表明Neocaesalpin L 在1.458～3.888 μg 范圍的線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（50 目篩）約5 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，超聲提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液12 μL 注入高效液相色譜儀， 連續進樣6 次， 測得Neocaesalpin L 的峰面積RSD 為0.32%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性考察

精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h進樣12 μL，測得Neocaesalpin L 的峰面積RSD 為1.14%（n = 6），表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.1.6 重復性試驗

取同一批號樣品6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣12 μL，測得Neocaesalpin L 含量的RSD 為1.95%（n = 6），表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密稱定已測含量的同一批樣品，共9 份，分別精密加入樣品的80%、100%、120%的Neocaesalpin L對照品各3 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取12 μL 進樣， 按上述色譜條件測定峰面積，計算加樣回收率。 結果Neocaesalpin L 平均回收率為96.76%，RSD = 1.59%（n = 9）。

2.2 提取工藝的優化

2.2.1 單因素試驗[7-8]

2.2.1.1 提取方法考察 精密稱取苦石蓮粉末（50 目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按 “2.1.1” 項下色譜條件進樣測定Neocaesalpin L 的含量，比較超聲法、回流法、浸漬法的提取效果，結果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.4365、0.2092、0.3288 mg/g 生藥材，以超聲提取為佳。2.2.1.2 乙醇體積分數考察 精密稱取苦石蓮粉末（50目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，分別加100 mL體積分數為50%、60%、70%、80%、95%的乙醇， 超聲提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解， 并轉移至10 mL 容量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定Neocaesalpin L 的含量，結果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.1702、0.1723、0.1781、0.2033、0.4942 mg/g生藥材， 故正交試驗乙醇體積分數為70%、80%、95%。

2.2.1.3 提取時間考察 精密稱取苦石蓮粉末（50 目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，分別加100 mL 95%乙醇，超聲提取2 次，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1” 項下色譜條件進樣測定Neocaesalpin L 的含量， 結果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.3560、0.6838、0.6312、0.4323、0.4297 mg/g 生藥材，故正交試驗選擇提取時間為1.0、1.5、2.0 h。

2.2.1.4 提取次數考察 精密稱取苦石蓮粉末（50 目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，分別加100 mL 95%的乙醇， 超聲提取4 次，1 h/次， 提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定Neocaesalpin L 的含量，結果顯示Neocaesalpin L 的 含 量 分 別 為0.4684、0.1700、0.029、0 mg/g生藥材， 故正交試驗提取次數因素的3 個水平為1、2、3 次。

2.2.1.5 乙醇用量考察 精密稱取苦石蓮粉末 （50 目篩）5 g， 置于250 mL 具塞錐形瓶中， 分別加10、15、20、25、30 倍95%的乙醇，超聲提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1” 項下色譜條件進樣測定Neocaesalpin L 的含量， 結果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.2978、0.4901、0.6003、0.6228、0.6245 mg/g 生藥材，可知隨著溶劑量增大，Neocaesalpin L 的提取率也相應增高，但達到20 倍后提取率沒有明顯提高，考慮到提取成本，故正交試驗確定乙醇用量因素的3 個水平為15、20、25 倍。

2.2.2 提取工藝的優化

2.2.2.1 正交試驗因素與水平的選擇 根據單因素實驗的結果和相關文獻報道[9-17]， 選擇乙醇體積分數（A）、提取次數（B）、提取時間（C）、乙醇用量（D）為考察因素，每個因素設置3 個水平，采用L9（34）正交試驗表安排試驗。 正交試驗因素見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2.2.2 正交試驗結果 取苦石蓮粉末約5 g， 精密稱定，共9 份。按表1 中各條件進行超聲提取，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定Neocaesalpin L 含量，以此為評價指標進行分析。 由表2 可知，4 個因素對Neocaesalpin L 含量的影響順序依次為B＞A＞C＞D，由表3 可知，影響提取效果的主要因素是提取次數（B），其次是乙醇體積分數（A），次要因素是提取時間（C）和乙醇用量（D），其中乙醇用量的影響最小，故將其作為誤差統計用以檢驗其他因素作用的顯著性。各因素不同水平對Neocaesalpin L 提取效果的影響順序為B2﹥B3﹥B1，A3﹥A2﹥A1，C2﹥C1﹥C3，D3﹥D1﹥D2。 綜合以上分析，確定最佳提取條件為A3B2C2D3，即95%乙醇，提取次數2 次，提取時間1.5 h，每次用25 倍量溶劑。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

2.2.2.3 驗證試驗 為考察優化后最佳提取工藝的合理性，按該提取工藝條件進行3 批驗證試驗，結果顯示Neocaesalpin L 含量分別為0.6030、0.5828、0.5849 mg/g，說明本提取工藝穩定可行。

3 討論

本試驗采用正交試驗法，以二萜化合物Neocaesalpin L 提取率為指標， 對苦石蓮膠囊的提取工藝進行優選， 確定最佳提取工藝為25 倍量95%乙醇超聲提取2 次，1.5 h/次， 經驗證試驗表明該工藝條件穩定，為工業化大生產提供一定的參考價值。

中草藥的功效通常不是依靠單一成分的作用，而是多種活性成分共同作用的結果，僅對其中一個或者幾個成分來控制中藥制劑的質量、療效和穩定性不夠全面?？嗍彽闹饕瘜W成分為二萜類、黃酮類、植物甾醇類，目前已有文獻報道，采用可見分光光度法，以化合物Caesalpinins K 為對照品， 對苦石蓮總二萜的含量進行測定和提取工藝進行優化；以蘆丁為評價指標，通過單因素實驗和正交試驗優化苦石蓮總黃酮超聲波-乙醇提取工藝[18-19]。本試驗采用高效液相色譜法對苦石蓮中另一個二萜化合物Neocaesalpin L 含量進行測定，并以其為指標通過正交試驗優選苦石蓮膠囊的乙醇提取工藝，可作為其質量控制指標之一，也可以為苦石蓮藥材的進一步開發提供實驗依據。

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