Cry1Ab蛋白對擬環紋豹蛛生長發育的影響

李秦晉， 魏寶陽 (.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 4028；2.湖南體育職業學院，湖南長沙 4009)

Cry1Ab蛋白對擬環紋豹蛛生長發育的影響

李秦晉1,2， 魏寶陽1(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.湖南體育職業學院，湖南長沙 410019)

[目的] 探明Cry1Ab蛋白通過培養基-果蠅-擬環紋豹蛛這一食物鏈的傳遞，最終在擬環紋豹蛛(Pardosapseudoannulata)體內的富集情況以及毒蛋白隨食物鏈的傳遞在各營養級中的變化規律。[方法]采用酶聯免疫技術(ELISA)測定Cry1Ab蛋白在擬環紋豹蛛和果蠅中的含量。[結果]Cry1Ab蛋白對不同齡期擬環紋豹蛛的體長、背甲寬、中眼域寬、腿長等生長指標不存在顯著性差異，但對體重產生一定的影響，使得其體重略有下降的趨勢。在0～10 d Cry1Ab蛋白在擬環紋豹蛛體內不斷累積，但10 d后擬環紋豹蛛體內Cry1Ab蛋白含量逐漸降低。[結論] Cry1Ab蛋白在擬環紋豹蛛體內具有富集效應。

擬環紋豹蛛；果蠅；Cry1Ab蛋白；食物鏈

盡管轉基因抗蟲作物可以帶來巨大效益[1-2]，但關于轉基因作物的生態安全性評價受到了世界各國政府部門和科技人員的重視，許多學者對轉基因作物的利弊及其潛在的生態環境問題進行了分析[3-8]。其中抗蟲轉Bt基因作物對害蟲天敵等非靶標昆蟲的潛在影響是當今轉基因生物安全性的研究熱點之一[9-13]。

擬環紋豹蛛(Pardosapseudoannulata)是稻田蜘蛛中的優勢種群[14]，農田作物害蟲最主要的捕食性天敵之一[15-22]。作為害蟲的重要捕食性天敵，Bt蛋白會隨水稻-害蟲-蜘蛛這一食物鏈傳遞，水稻中的Bt毒蛋白有可能會在蜘蛛體內積累，對其繁殖、生長和發育產生潛在影響。鑒于此，筆者模擬水稻食物鏈，構建實驗室Bt培養基-果蠅-蜘蛛這一食物鏈，以此探明Bt毒蛋白沿食物鏈的傳遞對蜘蛛毒害的生態效應，明確這種效應對蜘蛛生長、發育和繁殖的影響，同時也為Bt作物生態安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料在田間采集擬環紋豹蛛帶回室內飼養備用。

1.2 主要試劑Cry1Ab蛋白標準品(上海佑隆生物科技有限公司)，EnviroLogix Cry1Ab/Cry1Ac(ELISA)蛋白檢測試劑盒(上海佑隆生物科技有限公司)，SOD、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器電熱恒溫水浴鍋(DK-98-IIA)，天津市泰斯特儀器有限公司；可見分光光度計(V-5000型)，上海元析儀器有限公司；臺式低溫冷凍離心機，日本日立儀器有限公司；酶標儀(MK3型)，熱電(上海)儀器有限公司；電子分析天平(TMP-510)，湘儀天平儀器設備有限公司；恒溫恒濕培養箱(LRH-250-S)，廣東省醫療器械廠。

1.4 試驗方法

1.4.1擬環紋豹蛛的喂養。在同一非Bt水稻田塊采集帶有卵囊的擬環紋豹蛛，待卵囊孵化5 d后，將幼蛛接入2.5 cm的大型試管內(保證試驗蜘蛛均來自同一卵囊)，每管一頭，進行單頭飼養，每支試管中均置一團濕潤的脫脂棉，并每天加水3～4滴于脫脂棉上，為其提供水分。試驗組為每天喂食在含有Cry1Ab蛋白培養基上飼養5～10 d的果蠅，正常組為每天喂食在普通培養基上飼養5～10 d的果蠅。

每只幼蛛蛻皮后2 d，對其進行稱重，并從中取出2只幼蛛用75%的乙醇浸泡2h后進行生理指標的測定。

1.4.2Cry1Ab蛋白的提取。分別將試驗組和正常組的擬環紋豹蛛麻醉，每組取3只擬環紋豹蛛，將其麻醉后稱重，待其將要蘇醒時立即置于勻漿器中，加入250 μl提取液，在冰浴中將擬環紋豹蛛研磨成勻漿。將勻漿后的樣品液于高速冷凍離心機中以4 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清液用于ELISA檢測Cry1Ab蛋白含量，-20 ℃儲存備用。

1.4.3Cry1Ab蛋白含量測定(ELISA)。

1.4.3.1Cry1Ab蛋白標準曲線的制作。取標準CrylAb蛋白用樣品提取緩沖液依次稀釋成1、2、4、6、8 ng 5個梯度，按照試劑盒說明的方法進行測定，制作標準曲線。

1.4.3.2酶聯免疫技術(ELISA)。取5 μl待測樣品，加入45 μl提取液，將待測樣品稀釋10倍，在微孔板的每孔中加入50 μl酶標記Cry1Ab/Cry1Ac后，立刻加入50 μl空白對照(提取液)、陽性對照和樣品稀釋液，輕搖混勻20～30 s；微孔板上加蓋防止液體蒸發，室溫下溫育2 h后小心地揭去蓋，搖勻微孔內液體，并加入洗滌緩沖液沖洗，用力棄去微孔中的液體，重復3次；接著在每孔中加入300 μl洗滌液洗滌，并在紗布上拍干，每孔中加入100 μl底物溶液，輕搖混勻20～30 s，微孔板上加蓋，室溫下溫育15～30 min，每孔中加入100 μl 終止液，充分混勻后用酶標儀在450 nm波長下讀取OD值，用測試孔OD-空白孔OD，對照標準曲線得到Cry1Ab蛋白的含量(ng)，將結果換算成可溶性蛋白中含有的Cry1Ab蛋白量(ng/mg)。

1.5 數據分析采用WPS Excel軟件進行數據處理 ,并用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。數據均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 生長指標由表1可知，Bt蛋白對不同齡期擬環紋豹蛛的體長、中眼域寬和背甲寬等生長指標不存在顯著性差異。

表1 不同齡期擬環紋豹蛛生長指標 cm

2.2 重量由表2可知，Bt蛋白對不同齡期擬環紋豹蛛的重量有一定影響，使得其體重略有下降趨勢。在5齡時，體重的差異性最大(4齡、5齡存在顯著性差異)。

表2 不同齡期擬環紋豹蛛重量 mg

2.3 蛋白含量由表3可知，在0～10 d Cry1Ab蛋白在果蠅體內的含量隨著培養時間的延長而不斷增加，表明Cry1Ab蛋白的確在果蠅體內有富集作用，但在10 d后Cry1Ab蛋白含量下降，但在15 d時含量仍高于對照。 由表4可知，第1～7天Cry1Ab蛋白在擬環紋豹蛛體內均具富集作用(P<0.05)，到第7天時達到最高值，達極顯著差異(P<0.01)，然后逐漸降低，但仍顯著高于對照(P<0.05)。

表3 不同培養時間果蠅體內Cry1Ab蛋白含量

表4 不同齡期擬環紋豹蛛體內Cry1Ab蛋白含量

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

有關抗蟲轉Bt基因作物對其非靶標植食者及天敵的正面或負面影響已有較多報道[2,23-25]，但僅分析了溫室或田間條件下轉基因作物對供試對象生物學、生態學特性的影響，而極少探討Bt殺蟲蛋白能否在轉基因植物-非靶標植食者-天敵三者間進行轉移與富集。該試驗對培養基中的CrylAb毒蛋白在果蠅體內的積累作用進行了研究，發現CrylAb毒蛋白在果蠅體內的含量隨取食時間的延長先增加后下降。而喂食含有CrylAb毒蛋白果蠅的擬環紋豹蛛體內CrylAb毒蛋白也呈先增加后下降的趨勢。CrylAb毒蛋白能夠在果蠅及擬環紋豹蛛體內產生富集效應，而后蛋白含量下降，可能是由于隨取食時間的延長，CrylAb毒蛋白對果蠅和擬環紋豹蛛造成了影響，使個體生活力下降，取食量下降，攝入的CrylAb毒蛋白較少所致；也可能是由于培養基中的CrylAb蛋白已耗盡，而果蠅體內的CrylAb毒蛋白被降解而造成。目前的研究是在較短時間內得出的，長期作用結果如何，以及具體機理尚有待進一步跟蹤研究。

該試驗以Bt非靶標生物果蠅作為蜘蛛的食物來源，探討Bt毒素在Bt培養基-果蠅-蜘蛛這一食物鏈中的傳遞和累積規律，以及Bt蛋白的富集對蜘蛛生長發育的影響，可在一定程度上揭示轉Bt蛋白對稻田蜘蛛長期安全性的影響。其次，通過同一母體的幼蛛在Bt毒蛋白脅迫下對其生長發育影響，最大可能地消除蜘蛛個體間的差異，使得試驗更具參考意義

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Effect of Cry1Ab Protein on Growth ofPardosepseudoannulata

LI Qin-jin1,2,WEI Bao-yang1(1.College of Bioscience & Biotechnology,Hunan Agriculture University,Changsha,Hunan 410128;2.Hunan Sports Vocational College,Changsha,Hunan 410019)

[Objective] The aim was to prove food chain transfer of Cry1Ab protein through the medium-fruit flies and intends toP.pseudoannulata, the final accumulate inP.pseudoannulatabody as well as toxic protein variation in each trophic level with the transfer of the food chain.[Method]Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) the content of Cry1Ab protein in theP.pseudoannulataandDrosophilamelanogasterwas determined.[Result]The results showed that,there was no signifant difference that Cry1Ab protein on body length,carapace width,the width of the eye domain,legs and other growth indicators ofP.pseudoannulatain different ages,but had a certain impact on body weight,so its weight was slightly a downward trend.Cry1Ab protein within 0-10 d accumulated inP.pseudoannulatabody,but after 10 days Cry1Ab protein content intended to decrease.[Conclusion] The study had shown the Cry1Ab protein enrichment effect ofP.pseudoannulatabody.

Pardosapseudoannulata;Drosophilamelanogaster; Cry1Ab protein; Food chain

國家自然科學基金項目(31472017)；湖南省科技廳重點項目(2014FJ2003)。

李秦晉(1975- )，男，湖南益陽人，講師，在讀博士，從事農業生態學研究。

2015-03-31

S 188

A

0517-6611(2015)14-013-03