施肥對桑樹根際解有機磷細菌的影響

鄧文　郭冬各　于翠　等

摘要：利用選擇性培養基，對不同施肥桑樹根際解有機磷細菌進行分離、篩選，并采用Biolog自動微生物系統進行鑒定，分析不同施肥桑樹根際解有機磷細菌的數量和多樣性及土壤養分含量的變化。各施肥處理分離到的菌屬主要包括貪噬菌屬、氣單胞菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬和伯克氏菌屬等。施用3 000 kg/hm2桑樹專用有機-無機復混肥（TA）處理的土壤中解有機磷細菌數量、種群結構、Shannon-Wiene多樣性指數（H）和豐富度（S）均高于其他施肥處理。TA處理可提高土壤有機質、速效氮、速效磷和速效鉀含量。相關性分析表明，TA處理土壤中解有機磷細菌數量與土壤速效磷含量呈極顯著正相關，相關系數為0.66；空白（CK）處理的土壤中解有機磷細菌數量與速效鉀含量呈顯著負相關，相關系數為-0.62。

關鍵詞：施肥；桑樹；解有機磷細菌

中圖分類號：S888.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5383-04

桑樹是我國重要的經濟作物，合理施肥對提高桑葉的產量和品質十分重要[1，2]。在蠶桑生產中，主要通過施入化學磷肥補充桑樹對磷的需求，但是桑樹對磷肥的利用率很低，長期施用化學磷肥，一方面會導致大量磷素在桑園土壤中積累，造成磷資源的浪費，另一方面引起桑園土壤中各種養分的失衡，最終將會影響桑樹的生長[3，4]。

植物根際解磷細菌不僅可以將難溶性磷轉化為植物可以直接吸收利用的可溶性磷，提高磷肥利用率，而且對植物生長起到一定程度的促生作用。林啟美等[5]報道，解磷細菌的數量受土壤類型、土壤肥力等的影響。吳凡等[6]對不同肥力條件下桑樹根際微生物的種群分析表明，肥沃土壤解磷細菌的數量和種類均高于貧瘠土壤。羅明等[7]發現，有機肥與N、P、K合理配施能有效促進磷細菌的生長繁殖，提高其數量和活性。本試驗分析不同施肥對桑樹根際解有機磷細菌數量和種群多樣性的影響，為通過合理施肥措施提高桑樹對磷的吸收利用及改善桑園土壤環境提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試桑樹

供試桑樹品種為湖桑32號，于1996年栽植于湖北省農科院經濟作物研究所桑樹種質資源圃，栽植密度為0.6 m × 1 m，低中干養成。

1.2 施肥處理

2009-2014年連續施肥試驗，每一種施肥處理小區按國家土壤肥力長期定位試驗標準統一設置為66.7 m2。供試桑樹專用有機-無機復混肥是根據桑園土壤特點及桑樹對養分的基本需求研制而成，其中N、P2O5、K2O的比例為15∶4∶6，有機質質量分數為20%。供試化肥為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀鎂（湖北宜化集團有限責任公司）。

4種施肥處理的方式如下所述。①按照3 000 kg/hm2的施用量施用桑樹專用有機-無機復混肥（TA）；②施用與TA處理等氮的尿素，即450 kg/hm2氮素（TB）；③施用與TA處理等氮、磷、鉀的復合肥，即450 kg/hm2氮素、120 kg/hm2 P2O5、180 kg/hm2 K2O（TC）；④未施肥處理（CK）。每年分別于3月份和夏伐后施肥2次，每個施肥處理4次重復，隨機排列。

1.3 土樣采集

分別于2012年施肥前（3月12日），夏伐前大蠶用葉期（5月18日），新梢旺長期（7月4日），新梢緩慢生長期（9月7日），新梢停長期（11月8日）采集土壤樣品。每個處理隨機選取5個采樣點，除去表土，取桑樹根部1～4 mm松散粘附于根面的土壤，裝入自封袋，帶回實驗室。將5個采樣點的土樣混勻，一部分在4 ℃冰箱保存，用于解有機磷細菌分離，一部分自然風干、過篩，用于土壤理化性質分析。

1.4 桑樹根際解有機磷細菌的分離、計數

采用蒙金娜有機磷培養基進行分離。每個土樣稱取5 g，放入盛有45 mL無菌水的100 mL三角瓶中，置于搖床上振蕩約20 min，取上清液以10倍稀釋法稀釋至10-4、10-5、10-6稀釋度，每個濃度設3個重復，28 ℃培養2～3 d后，統計具有溶磷圈的菌株數。解有機磷細菌進行劃線純化后，進行試管斜面培養用于鑒定。

1.5 桑樹根際解有機磷細菌的多樣性測定

參照常用細菌系統鑒定手冊，在解磷細菌選擇性培養基上觀察解有機磷細菌菌落特征，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態，對分離到的解有機磷細菌進行初步分類[8，9]。使用Shannon-Wiener多樣性指數（H）、豐富度指數（S）、Pielou均勻度指數（J）和Simpson優勢度指數（D）分析桑樹根際土壤解有機磷細菌的種群多樣性特征。多樣性指數的計算公式為H=-∑Pi㏑Pi，其中Pi=Ni/N，Ni為屬i單菌落的數量，N為土樣中總單菌落的數量；豐富度指數為屬i所在土樣中的數目；均勻度指數的計算公式為J=∑PilnPi/lnS；優勢度指數的計算公式為D=∑Pi2。

1.6 解有機磷細菌的Biolog自動微生物系統鑒定

將分離到的解有機磷細菌在牛肉膏蛋白胨培養基上活化和純化，挑取單菌落在BUG培養平板上劃線培養，至長出單菌落，制備均勻的菌懸液，使用八通道移液器將菌懸液加入Biolog GN III鑒定板，置于33 ℃培養，在4～6 h和16～24 h分別進行讀數。按可能性大?。⊿IM值）給出接近的種屬名稱，SIM值≥0.5為可接受的鑒定結果。

1.7 土壤基本理化性質分析

有機質含量測定采用重鉻酸鉀容量法，堿解氮含量測定采用堿解擴散法，速效磷含量測定采用碳酸氫鈉浸提法，速效鉀含量測定采用火焰光度法[10]。

1.8 數據統計

采用DPS v7.05版數據處理系統進行統計分析，Excel軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 施肥對桑樹根際土壤養分含量的影響

如表1所示，各取樣時期TA處理土壤有機質、速效氮、速效鉀含量均高于TB、TC及CK，且有機質和速效鉀含量差異達顯著水平（P<0.05）。TA和TB處理土壤速效磷含量高于TC、CK，且差異達到顯著水平（P<0.05）。說明桑樹專用有機-無機復混肥的施用可以提高土壤有機質、速效氮、速效磷和速效鉀的積累。

2.2 施肥對桑樹根際土壤解有機磷細菌數量的影響

如圖1所示，土壤解有機磷細菌數量全年表現先升高后下降的趨勢，各處理土壤解有機磷細菌數量均在5月18日達到最高值。TA處理在全年各取樣時期解有機磷細菌數量高于其他處理（除5月18日外），且差異達到顯著水平（P<0.05）。表明桑樹專用有機-無機復混肥的施用能夠更有效地提高桑園土壤解有機磷細菌數量。

2.3 不同施肥桑樹根際解有機磷細菌種群結構

由表2可知，不同施肥處理桑樹根際解有機磷細菌以革蘭氏陰性菌為主，分別屬于貪噬菌屬、氣單胞菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬和產堿菌屬等。與其他3種處理相比，TA處理種群結構豐富，可能是有機-無機復混肥的施用使得土壤有機物質含量豐富，從而有利于不同種類解有機磷細菌的生長繁殖。

2.4 施肥對桑樹根際土壤解有機磷細菌種群多樣性的影響

由表3可知，TA處理土壤解有機磷細菌種群多樣性指數（H）和豐富度指數（S）均最高，而均勻度指數（J）較低，可能是由于存在爭論貪噬菌和伯克氏菌屬的優勢菌群所致。因此，桑樹專用有機-無機復混肥的施用能夠提高桑園土壤解有機磷細菌的種群多樣性。

2.5 解有機磷細菌數量與土壤養分的相關性分析

由表4可知，TA處理土壤解有機磷細菌數量與土壤速效磷含量呈極顯著正相關，相關系數為0.66；CK處理土壤解有機磷細菌數量與速效鉀含量呈顯著負相關，相關系數為-0.62。說明施用桑樹專用有機-無機復混肥后土壤中速效磷含量提高，桑樹根際解有機磷細菌分布也增加。

3 小結與討論

3.1 施肥與桑樹根際土壤養分狀況

土壤有機質包括各種動植物殘體以及微生物及其生命活動所產生的各種有機物[11]，它一方面為植物的生長發育提供所需的營養元素，另一方面對形成土壤結構，改善土壤物理性狀，調節土壤水分、空氣、溫度有重要的作用。已有研究表明，有機肥配施化肥能明顯提高土壤活性有機質和總有機質的含量，使用有機肥料還能減少土壤対磷的固定，提高磷肥的有效性和利用率[12-15]。本試驗結果表明，TA處理有機質含量值高于TC、TD處理及CK，這說明施用3 000 kg/hm2桑樹專用有機-無機復混肥更有利于桑園土壤中有機質積累，而TB和TC處理土壤有機質含量變化差異較小，其原因有待連續多年深入研究。

土壤速效養分可被植物直接吸收利用，或在短期內能轉化為植物可吸收的養分，其含量是反應土壤養分供應能力的重要指標。已有研究表明，有機-無機肥料能夠減弱無機氮對土壤的酸化作用，提高土壤中速效氮、速效磷和速效鉀的含量，進而提高土壤速效養分的供給能力[16-20]。本試驗結果表明，施用3 000 kg/hm2桑樹專用有機-無機復混肥可以提高土壤速效氮、速效磷和速效鉀含量，原因可能是有機肥能夠減弱土壤礦物粘粒對磷的固定，同時有機肥含有的腐植酸的官能團與鉀離子結合，從而提高土壤的供磷能力和供鉀能力。

3.2 施肥與桑樹根際土壤解磷細菌數量及其種群結構

植物生長所必需的磷主要從土壤磷庫獲得，但施入的磷肥迅速轉化為難以直接吸收利用的遲效態磷，影響磷素利用率的關鍵問題是其在土壤中的有效性，土壤中解磷細菌的數量、種類和活性標志著土壤難溶性磷轉化和可被植物利用的狀況[21，22]。Luo等[23]研究表明，與化肥相比，施用有機肥能夠增加溶磷菌的數量。范丙全等[24]發現NPK、NPK+綠肥的施用都使土壤中解磷微生物數量降低、種類減少，可能是油菜產生的某些物質對溶磷細菌有殺死或抑制作用。本試驗結果表明，3 000 kg/hm2桑樹專用有機-無機復混肥的施用可提高土壤解有機磷細菌的種群多樣性。因此，桑樹專用有機-無機復混肥的施用不僅對維持土壤中各種養分的平衡有重要的作用，也為土壤中解磷微生物提供了有利的生長環境，而不同施肥處理對土壤解磷細菌的影響機制還有待進一步深入研究。

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（責任編輯 彭西甜）

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