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豬圓環病毒2型SYBR GreenⅠ熒光定量PCR診斷方法的建立

2015-01-20 11:37:37余波周思旋譚詩文
湖北農業科學 2014年22期

余波 周思旋 譚詩文 等

摘要:根據GenBank中豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計特異性引物,PCR擴增獲得豬圓環病毒2型ORF2基因片段,并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化,建立了豬圓環病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法。擴增產物的溶解曲線分析只出現1個單特異峰,無引物二聚體,對PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均無陽性信號,可重復性好,測靈敏度可達4.0×101拷貝/μL。結果表明,建立的豬圓環病毒2型SYBR Green I 實時熒光定量PCR具有特異、靈敏、快速、重復性好,適合于豬圓環病毒2型臨床樣品的檢測。

關鍵詞:豬圓環病毒2型;ORF2基因;SYBR Green I熒光定量PCR

中圖分類號:S854.4+3 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)22-5474-04

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)主要導致斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的發生,表現為免疫系統損傷,淋巴細胞減少、淋巴結腫大等病變,同時引起其他病原的繼發感染,目前已成為嚴重阻礙養豬業發展的主要病原之一[1-3]。目前檢測PCV-2主要有ELISA、膠體金、PCR等方法,但ELISA、膠體金主要用于檢測PCV-2抗體,且操作復雜、耗時長[4,5]。普通PCR不能進行定量分析,且靈敏度相對較低,無法檢測豬場的隱性感染。熒光定量PCR是與常規PCR比較,具有重復性好、靈敏度高、能夠定量等優點,已經被廣泛應用于多種疾病病原的檢測[6,7]。本研究根據GenBank中豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計特異性的引物,利用PCR技術擴增獲得豬圓環病毒2型ORF2基因片段,并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化,建立豬圓環病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法,為豬圓環病毒2型臨床樣品的檢測提供科學的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株:PCV-2、PRV閩-1株、PPV強毒株7909、CSFV、PRRSV、豬源大腸桿菌由貴州省畜禽疫病研究實驗室保存。

主要試劑及儀器:Goldview、Tris、EDTA、Taq DNA Polymerase(5U/μL)及相應10×Taq Buffer、dNTP、DH5α,pMD-18T、SYBR Green I熒光定量PCR酶等購自寶生物(大連)工程有限公司;TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR儀為Eppendorf Mastercycler ep realplex 4實時熒光定量PCR儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據ORF2 GenBank中豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計1對特異性引物,上游引物:5′-GGAAGACCAATGTACACGTCATT-3′,下游引物:5′-GGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTC-3′,引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1)組織樣品:取待檢樣品淋巴結組織樣品共約0.5 g,加入500 μL PBS緩沖液,待檢樣品研磨后-70 ℃反復凍融3次,12 000 r/min離心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行,將提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。豬大腸桿菌參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行,將提取的DNA-20 ℃保存。

2)血清樣品:取50 μL血清加入等體積的血清裂解緩沖液(50 μmol/L Tris-HCl(pH 8.0),150 μmol/L NaCl,2 μmol/L EDTA,1%Triton×100,5%SDS),混勻后煮沸5 min,12 000 r/min離心取上清液2 μL用于熒光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PCV2-ORF2陽性標準品的制備

用“1.2.1”中的引物,對PCV-2進行PCR擴增,反應條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環; 72 ℃ 10 min。將擴增的目的片段與pMD-18-克隆載體連接,轉化感受態細胞DH5α,重組體命名為pMD-18T-PCV2-ORF2,同時送寶生物工程(大連)有限公司測序。用紫外分光光度計測定測序正確的重組質粒pMD-18T-PCV2-ORF2在D260 nm/D280 nm處的吸光度,得到重組質粒的濃度和純度,進行10倍梯度倍比稀釋,作為陽性標準品。

1.2.4 熒光定量PCR反應條件的優化 熒光定量PCR反應在25 μL反應體系中進行,對熒光定量PCR反應條件,包括退火溫度(50、55、60 ℃)、引物濃度(5、10、20 μmol/L)進行優化以確定最佳反應條件。上下游引物(5、10、20 μmol/L)各1 μL,Premix Ex Taq 12.5 μL,ROX Reference Dye 0.5 μL,模板1 μL,用超純水補足至25 μL,同時以去離子水作為空白對照。反應條件為:94 ℃ 10 s;94 ℃ 5 s、退火溫度(50、55、60 ℃)10 s、72 ℃10 s,40個循環。

1.2.5 熒光定量PCR反應標準曲線的建立 用紫外分光光度計測定測序正確的重組質粒pMD-18T-PCV2-ORF2,計算出重組質粒的濃度和純度,計算DNA拷貝數,隨后將標準陽性樣本進行連續10倍系列稀釋,以“1.2.4”的條件進行擴增,每個稀釋倍數3個重復,以拷貝數為橫坐標,以Ct值為縱坐標建立標準曲線。

1.2.6 敏感性試驗 將重組質粒pMD-18T-PCV2-ORF2計算DNA拷貝數后,進行10倍比稀釋后分別進行熒光定量PCR反應,每個稀釋倍數3個重復,以確定建立的熒光定量PCR診斷的敏感性。

1.2.7 特異性試驗 以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進行熒光定量PCR反應,每個樣品3個重復,以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。

1.2.8 重復性試驗 應用建立的熒光定量PCR方法重復檢測PCV-2 DNA樣品3次,以檢驗結果的可靠性。

1.2.9 熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測 對2012~2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區幾個生豬養殖場和養殖專業戶采集的75份疑似病料(組織),194頭份發病豬場未發病豬血清,應用建立的熒光定量PCR檢測方法進行檢測,同時應用文獻[8]中的方法進行普通PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 pMD-18T-PCV2-ORF2陽性標準品的制備

用“1.2.1”中的引物,對PCV-2進行PCR擴增,能有效擴增出目的片段,片段大小為105 bp,無非特異性片段產生(圖1)。將寶生物(大連)工程有限公司測序結果與GenBank中的PCV-2 ORF2基因序列比對,核苷酸相似度為98.9%~100%。

2.2 熒光定量PCR反應條件的優化

熒光定量PCR反應在25 μL反應體系中最佳反應條件為:退火溫度55 ℃,引物濃度10 μmol/L,能出現最高的熒光值、最小的Ct值,且在溶解曲線分析中不出現非特異性峰。

2.3 熒光定量PCR反應標準曲線的建立

將標準樣品10倍倍比稀釋,取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101拷貝/μL 7種不同濃度重組質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增反應,得到擴增反應的標準曲線(圖2),線性回歸方程為Ct=-2.894×lgcopies+32.89(R2=0.994)。

2.4 溶解曲線分析

在SYBR Green I熒光定量PCR結束后對擴增反應溶解曲線分析,結果見圖3。由圖3可見,擴增產物的溶解溫度Tm為84.0~84.4 ℃,沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現。

2.5 敏感性試驗

將標準樣品倍比稀釋,取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101、4.0×100拷貝/μL 8種不同濃度重組質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增。由圖4可見,結果顯示其靈敏度為4.0×101拷貝/μL。

2.6 特異性試驗

由圖5可見,以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進行熒光定量PCR反應,以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。結果PCV-2為陽性,而PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA為陰性。

2.7 重復性試驗

應用建立的熒光定量PCR方法重復檢測PCV-2 DNA樣品3次,以檢驗結果的可靠性,結果均一致。

2.8 熒光定量PCR對臨床樣品的檢測

對2012~2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區幾個生豬養殖場和養殖專業戶75份疑似病料(組織)熒光定量PCR陽性率為29.3%(22/75),普通PCR陽性率為29.3%(22/75)。194頭份發病豬場未發病豬血清熒光定量PCR陽性率為9.2%(18/194),普通PCR陽性率為0%(0/194)。

3 小結與討論

目前利用PCR技術或者是血清學方法對豬場中的PCV-2感染情況進行檢測是控制PMWS的有效方法[9]。普通PCR在PCV-2的凈化中發揮了重要作用,但普通PCR檢測的靈敏度相對較低,主要用于組織病料的檢測,不能有效檢出豬群血清中PCV-2的隱形感染。陳蓉等[10]建立基于TaqMan探針的豬圓環病毒2型熒光定量PCR檢測方法,該方法的敏感性為6×101拷貝/μL,比普通PCR高2個數量級,對臨床樣本的陽性檢出率(64%)明顯高于普通PCR(44%)。曾思遙等[11]以豬圓環病毒2型核衣殼蛋白ORF2基因,設計合成特異性引物和探針,建立了PCV-2的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法,可達100拷貝/μL,可有效檢測出淋巴結、肺臟等組織中的PCV-2,但其未對感染豬場未發病豬血清進行檢測。

基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量PCR技術則無需探針,且價格較TaqMan探針低廉,雖然引物二聚體及非特異性擴增可能影響檢測結果的特異性,但可以通過融解曲線分析克服這一缺陷[12]。本研究根據豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計特異性的引物,利用PCR技術擴增獲得豬圓環病毒2型ORF2基因片段,并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化,建立了豬圓環病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法,靈敏度可達4.0×101拷貝/μL,擴增產物的溶解溫度Tm為84.0~84.4℃,沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現,適合于PCV-2臨床樣品的檢測。

本研究中75份疑似病死豬病料(組織)中病毒含量量較高,因此熒光定量PCR和普通PCR符合率為100%,而發病豬場未發病豬血清PRV病毒含量較低,普通PCR未檢測到血清中的病毒,而建立的實時熒光定量PCR能檢測到PCV-2 DNA。且本研究建立的血清中病毒提取方法,能夠快速的提取病毒DNA。因此,本研究建立的PCV-2 SYBR Green I 實時熒光定量PCR可應用于PCV-2早期感染和隱性感染檢測,有利于豬場PCV-2的凈化。

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(責任編輯 程碧軍)

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(責任編輯 程碧軍)

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