鱉源致病性嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

林鋒　劉莉　曹錚　等

摘要：從患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）肺組織中分離到優勢菌1株，進行了表型特征分析和16S rDNA序列測定。結果表明，該菌為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），通過對健康中華鱉進行人工感染，發現該菌具有致病性；選取20種常規藥敏試紙進行藥敏試驗，結果表明，該嗜水氣單胞菌對慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感，對諾氟沙星、紅霉素、阿米卡星、環丙沙星中敏，對其他11種抗生素具有耐藥性。

關鍵詞：鱉（Pelodiscus sinensis）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；16S rDNA；藥敏試驗

中圖分類號：S943 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5487-03

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種條件性致病菌，廣泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，對水產動物、畜禽和人類均有致病性[1]。嗜水氣單胞菌作為淡水養殖動物重要的病原菌之一，目前已確定淡水魚類細菌性敗血癥、鱉“紅底板”病等多種病害是由其所導致的[2，3]，給水產養殖業造成極大的經濟損失。近年來，抗生素的普遍使用導致了嗜水氣單胞菌的耐藥性也日趨嚴重[4]。因此，本研究通過對患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）體內的病原菌分離、16S rDNA序列分析來鑒定病原菌的類別，并利用藥敏試驗來初步篩選治療該病癥的藥物，開展典型性中華鱉病癥的研究，有利于針對不同的病癥采取有效的治療措施，降低經濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2013年4月，取自浙江省湖州市南潯區某中華鱉養殖場外塘，病鱉體重為820 g左右。臨床癥狀為頸部腫大，腹部有氣脹感；部分嚴重者口鼻出血。病理剖檢發現肺腫大，部分呈粉紅色；肝脾略有腫大，有的呈花斑狀；咽喉上皮處有顆粒狀的突起。從開始發現到陸續性死亡時間為7～15 d，累積死亡率近70%。

1.1.2 培養基及試劑 營養肉湯干粉、瓊脂干粉、細菌理化特性鑒定用的培養基和藥敏試紙購自杭州天和微生物公司； 革蘭氏染液購自南京建成生物工程研究所；PCR擴增試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 在無菌條件下，用酒精棉球擦拭患病鱉體表后進行解剖，取血、心、肝、脾和腸等組織樣品，分別在營養瓊脂培養基平板（pH 7.4）上劃線培養，28 ℃恒溫培養12 h，根據菌落特征，挑取單菌落劃線分離。

1.2.2 細菌形態觀察 將分離菌接種于培養基平板上，置于 28 ℃培養12 h，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察菌體形態和染色特征。

1.2.3 致病性試驗 將分離菌接種于液體營養培養基中，置于28 ℃振蕩培養6 h，取菌體涂片鏡檢，確認純度后低速離心收集沉淀，加入滅菌生理鹽水制成細菌懸液。取6只中華鱉分為試驗組和對照組，每組 3只。試驗組每只鱉肌肉注射0.5 mL 細菌懸液（濃度約為1×109 CFU/mL）；對照組每只注射0.5 mL生理鹽水，分別隔離飼養，記錄發病和死亡情況。

1.2.4 16S rDNA序列測定 16S rDNA基因序列的擴增采用細菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R： 5′-TACGGTTACCTT GTTACGACTT-3′。擴增片段大小約1 470 bp。PCR擴增反應體系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶 0.5 μL，模板菌液3 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。

1.2.5 藥敏試驗 藥物敏感性試驗按紙片擴散法[5]進行，測定抑菌圈直徑，并參照NCCLS判斷標準[6]進行敏感性判定。檢測的抗生素包括青霉素G、頭孢他啶、頭孢西丁、復達欣、萬古霉素、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、阿米卡星、強力霉素、四環素、氯霉素、紅霉素、復方新諾明、呋喃妥因、呋喃唑酮、諾氟沙星和環丙沙星等20種。

2 結果與分析

2.1 細菌的形態特征

從患病的中華鱉肺組織中分離到一種優勢菌，標記為J。細菌J染色后呈紅色，短桿狀，兩端鈍圓，直形或弧形，單個或成對排列，初步判定為革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。

2.2 細菌致病性試驗

健康中華鱉接種細菌J的懸液。接種后12 d對照組正常，而感染組則出現死亡。對死亡鱉進行分菌培養，經染色、鏡檢為相同菌株。結果表明，分離菌J具有致病性，且感染中華鱉后出現典型性特征即肺腫大（圖2）。

2.3 細菌16S rDNA序列鑒定

利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增（圖3），獲得了菌株的核苷酸序列。將核苷酸測序結果通過BLAST比對，發現菌株J與GenBank上收錄的嗜水氣單胞菌同源性高達99%，根據細菌J的表型特征和生理生化特性，可以判定細菌J與嗜水氣單胞菌為同一屬的細菌。

2.4 藥敏試驗

選取常用的20種抗生素藥敏紙片，對嗜水氣單胞菌J進行藥敏試驗。結果（表1）表明，嗜水氣單胞菌J對慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感，對諾氟沙星、紅霉素、阿米卡星、環丙沙星中敏，對其他11種抗生素有耐藥性。

3 小結與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優勢菌株，經革蘭氏染色進行表型分析，結合目前正逐步廣泛用于養殖環境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[7，8]，較快速、準確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細菌回感試驗，發現該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發紅。而藥敏試驗結果表明，這種菌有較強的耐藥性。到目前為止，研究已經發現氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細胞外毒素[9-11]，從而引發中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發病快、持續性死亡的特征，且死亡率達到70%左右，屬于高致病菌株，對其研究有利于為診斷和治療提供科學依據。

參考文獻：

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[17] 孫紅祥，舒妙安.中華鱉幾種常見疾病病原的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫學報，2002，22（2）：140-142.

（責任編輯 屠 晶）

3 小結與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優勢菌株，經革蘭氏染色進行表型分析，結合目前正逐步廣泛用于養殖環境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[7，8]，較快速、準確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細菌回感試驗，發現該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發紅。而藥敏試驗結果表明，這種菌有較強的耐藥性。到目前為止，研究已經發現氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細胞外毒素[9-11]，從而引發中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發病快、持續性死亡的特征，且死亡率達到70%左右，屬于高致病菌株，對其研究有利于為診斷和治療提供科學依據。

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（責任編輯 屠 晶）

3 小結與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優勢菌株，經革蘭氏染色進行表型分析，結合目前正逐步廣泛用于養殖環境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[7，8]，較快速、準確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細菌回感試驗，發現該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發紅。而藥敏試驗結果表明，這種菌有較強的耐藥性。到目前為止，研究已經發現氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細胞外毒素[9-11]，從而引發中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發病快、持續性死亡的特征，且死亡率達到70%左右，屬于高致病菌株，對其研究有利于為診斷和治療提供科學依據。

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（責任編輯 屠 晶）