高效液相色譜法同時測定鳳仙花中槲皮素和山奈酚含量

魏紅立 劉俊霞 侯文欣 呂勤芝

鳳仙花(impatiers balsomina)為鳳仙花科植物風仙的花，該植物全草、根、種子均可入藥，具有祛風除濕、活血、消腫、止痛之功效，用于治療跌打損傷，腰腹疼痛，癰疽，療瘡，鵝掌風，灰指甲等癥［1，2］。文獻報道，鳳仙花的有效成分為黃酮類和奈醌衍生物［3，4］，其中槲皮素能溶于冷乙醇(1∶290)，易溶于熱乙醇(1∶23)，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，幾乎不溶于水，山奈酚微溶于水，溶于熱乙醇，乙醚和堿。槲皮素是一種重要的黃酮類化合物，槲皮素具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用，用于治療慢性支氣管炎。文獻報道有方法同時測定蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量［5］，經我們實驗驗證，重現性差。經查閱資料鳳仙花中蘆丁經酸水解后生成槲皮素，我們懷疑重現性差的原因可能與蘆丁未水解完全有關，另外，該方法提取耗時長。因此，我們對該方法進行改進。為更好的開發利用該藥材資源提供理論依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters e2695)二極管陣列檢測器、Shimadzu 2010A高效液相色譜儀(LC-2010A HT低壓四元梯度泵、自動進樣器、紫外檢測器)LC-Solution工作站軟件色譜柱:SHIMADZU(Shim-pack VP-ODS Column Size 250 mm ×4.6 mm 5 μm Serial No.4062928);Sartorius萬分之一和 Sartorius十萬分之一電子天平;KQ-600D型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。8批鳳仙花樣品產地分別為河北安國、云南、安徽、河南、內蒙、湖北、山東。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液的制備:分別精密稱取槲皮素和山奈酚對照品適量，用甲醇稀釋，制成濃度分別為0.02 mg/ml和0.1 mg/ml的混合溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備:精密稱取本品粉末0.5 g，加入25%鹽酸4 ml，再加入甲醇16 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，功率420 W，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量。過濾，濾液中加入20 ml水，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(150 mm × 4.6 mm，5 μm)。流動相:甲醇-0.4% 磷酸溶液(50∶50);檢測波長:360 nm;流速:0.7 ml/min;柱溫 30℃。

2.2 專屬性 取混合對照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件測定，并采用二極管陣列檢測器對峰純度進行測試，表明其他成分不干擾被測成分的測定。見圖1～4。

圖1 混合對照品

圖2 樣品HPLC色譜圖

2.3 線性關系考察

圖3 對照品峰純度圖

圖4 樣品峰純度圖

2.3.1 精密稱取槲皮素對照品(批號:100081-200907含量以 96.5%計)10.36 mg，置 10 ml量瓶中，作為儲備液。再分別精密吸取 1 ml置100 ml、50 ml、25 ml、10 ml、5 ml、2 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得一系列濃度的溶液。精密吸取上述6種溶液各10 μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以色譜峰峰面積為縱坐標(Y)，以濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程為:Y=5.608 ×107X+8.018 ×104，R2=0.9999。表明槲皮素在 0.1000 μg ～ 4.9987 μg 范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密稱取山奈酚對照品(批號:110861-201209含量以93.2%計)10.49 mg，置10 ml量瓶中，作為貯備液。再分別精密吸取 1 ml置 100 ml、50 ml、25 ml、10 ml、5 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得一系列濃度的溶液。精密吸取上述5種溶液和貯備液各10 μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以色譜峰峰面積為縱坐標(Y)，以濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程為:Y=5.7267 ×107x+3.8767 ×104，R2=0.9998。表明山奈酚在0.098 ～9.777 μg 范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗 精密稱取槲皮素對照品(批號:100081-200907含量以 96.5%計)10.69 mg置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。再精密量取2 ml置100 ml的量瓶中。精密稱取山奈酚對照品(批號:100861-201209含量以 95.9%計)10.86 mg置上述100 ml的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制成二者的混合溶液。精密吸取上述混合溶液10 μl，連續進樣6次，槲皮素色譜峰面積的RSD值為0.26%，山奈酚峰面積的RSD為0.28%。表明用該方法測定槲皮素和山奈酚精密度良好。

2.5 穩定性試驗 儀器自動精密吸取供試品溶液(4號)10 μl，注入高效液相色譜儀，分別在 0、2、4、8、12、24 h進樣，計算峰面積的RSD，結果槲皮素色譜峰面積的RSD為0.62%，山奈酚色譜峰面積的 RSD為0.24%。表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗 稱取鳳仙花藥材粉末(1號)6份，每份 0.5 g，精密稱定，(1)0.4919 g，(2)0.5064 g，(3)0.5061 g，(4)0.5032 g，(5)0.5055 g，(6)0.5030 g，按照含量測定方法進行處理，結果槲皮素含量RSD為0.63%，山奈酚含量RSD為1.0%。表明本方法重復性良好，適用于鳳仙花中槲皮素和山奈酚的提取及含量的測定。

2.7 加樣回收試驗 稱取鳳仙花藥材(1號)6份，每份 0.5 g，精密稱定，(1)0.4995 g，(2)0.4970 g，(3)0.4980 g，(4)0.5010 g，(5)0.4910 g，(6)0.4912 g，分別置錐形瓶中。精密稱取槲皮素對照品(批號:100081-200907，含量以 96.5% 計)10.40 mg 置 10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 ml置25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。作為標加溶液，分別精密吸取4 ml此溶液置上述6個錐形瓶中。精密稱取山奈酚對照品(批號:110861-201209，含量以93.2%計)23.52 mg置25 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為標加溶液，分別精密量取2 ml置上述6個錐形瓶中。將加標樣后的6份樣品按照含量測定方法進行處理，計算回收率，槲皮素為102.27%，RSD為0.66%;山奈酚為 104.16%，RSD 為 0.83%。

2.8 耐用性試驗 分別采用ShimadzuLC-2010A液相色譜儀和 Welch Materials(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱、Waters e2695液相色譜儀和ODS-2HYPERSIL(250 mm，5 μm)色譜柱測定同批樣品。見表1。

表1 耐用性試驗結果 %

2.9 含量測定結果 共收集8批樣品，8批樣品按擬定的含量測定方法進行測定。見表2。

表2 含量測定結果

3 討論

供試品提取我們選擇了加入4 ml、8 ml鹽酸兩種方案，結果加入4 ml、8 ml鹽酸后含量測定結果沒有明顯區別，因此我們選擇加入4 ml鹽酸水解。加酸后放置1 h、2 h時間對測定結果沒有明顯影響。因此，加酸后不放置。經驗證用乙酸乙酯萃取3次，每次20 ml，可將待測成分完全萃取出來。

與文獻［6，7］方法比較該方法耗時短，操作簡便，重現性較好，能夠為鳳仙花的開發利用提供理論依據。

1 怡悅.鳳仙花的抗過敏作用機制的研究.國外醫學(中醫中藥分冊)，1998，20:57.

2 于麗云.鳳仙花屬植物提取物治療皮膚感染、炎癥和過敏反應.國外醫藥(植物藥分冊)，1994，9:134.

3 危建安，謝琪.鳳仙花研究進展.時珍國醫國藥，2001，12:164-165.

4 胡喜蘭，朱慧，劉存瑞，等.鳳仙花的化學成份研究.中成藥，2003，25:833-834.

5 郝治湘，劉玉芬，周麗華.反相高效液相色譜法測定鳳仙花中蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量.化工時刊，2006，20:42-43、49.

6 高靈玲.楊小平鳳仙花藥材性狀與粉末顯微特征鑒別.中藥材，1988，21:290.

7 王曉飛，于玲，杜華霜，等.三白草中槲皮素的薄層色譜鑒別.中國民族民間醫藥，2010，23:61.