基于OptiPrep的循環腫瘤細胞富集體系研究

鄭羅凝, 徐增輝, 王 真, 錢其軍,

(1. 浙江理工大學生命科學學院, 杭州 310018; 2. 第二軍醫大學東方肝膽外科醫院, 上海 200438)

基于OptiPrep的循環腫瘤細胞富集體系研究

鄭羅凝1, 徐增輝2, 王 真2, 錢其軍1,2

(1. 浙江理工大學生命科學學院, 杭州 310018; 2. 第二軍醫大學東方肝膽外科醫院, 上海 200438)

建立一種簡易高效的外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)富集方法。配比不同濃度的OptiPrep溶液梯度離心分離外周血各細胞成分,比較OptiPrep液與現行Ficoll液富集腫瘤細胞的效率、回收率、活性率。以此系統富集腫瘤患者血樣中的CTC,結合免疫磁珠篩選、染色體原位熒光雜交和表面抗原免疫熒光技術精確鑒定CTC細胞。結果顯示OptiPrep液以1.079 g/mL的密度濃度在1 900 r/min離心20 min為最優分離條件。32例臨床腫瘤患者血樣的CTC檢測實驗中,均發現有循環腫瘤細胞的存在。結果表明基于OptiPrep液結合免疫磁珠篩選能有效富集外周血循環腫瘤細胞,為實驗室常規開展CTC的計數、培養等研究奠定基礎。

OptiPrep分離介質; 密度梯度離心法; 循環腫瘤細胞; 免疫磁珠

0 引 言

循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)從原發腫瘤病灶脫落下來,通過血液循環系統傳播到遠端器官,在新的環境中生長并形成轉移病灶。目前認為,腫瘤復發的關鍵在于CTC潛在的侵襲能力[1]。有報道顯示CTC檢測及其預后相關性對于評估臨床治療效果十分有意義。除了轉移性癌癥患者的預后價值以外,CTC對于早期癌癥的預測價值也很有吸引力[2]。因而CTC成為研究癌癥治療和轉移潛在機制的重要生物標志物。然而,外周血中能檢測到的CTC個數極少,每7.5 mL血液中可能僅含幾個[3],從而對血液中富集CTC這一技術提出了挑戰。

當前的富集方法主要是基于細胞的物理特性(大小和密度),包括密度梯度離心分離,微孔過濾,ISET(上皮腫瘤細胞大小分選)等[4-5]。已經獲得美國FDA批準的CellSearch用作晚期乳腺癌、結腸直腸癌以及前列腺癌的預后[6]。它是基于細胞表面特異生物標記物,從而分離血液中的CTC,以此為技術的方法必須預先了解待測癌細胞的特異抗原,因而不能通用于所有癌癥,容易漏檢或錯檢。另外,此技術試驗成本高(約5000元/例),設備費用更是高昂,一般實驗室難以承受。為了克服這種局限性,考慮去除血液中的紅細胞、血漿和大量白細胞,留存CTC以達到富集的目的。

密度梯度離心是根據細胞密度分選多種細胞,可有效去除紅細胞和血漿等。分離的關鍵因素是高質量的分離介質。目前應用于細胞分離的介質主要有Ficoll、Percol、Nycodenz和Onco-Quick[7],Percol的價格雖然較低,但是很難聚集細胞形成清晰的條帶,Nycodenz為固體,配制復雜且不易控制濃度。本研究為采用OptiPrep法分離外周血CTC。OptiPrep是一種60%的Iodixanol水溶液,Iodixanol則是非離子等滲分子[8]。相比而言,OptiPrep液體配制簡便,對細胞的損傷較小,富集條帶明顯,細胞純度高。已有研究發現OptiPrep主要應用于鼠原代肝星狀細胞的分離純化,且使用OptiPrep純化胰島細胞可能有助于增加胰島移植的成功[9]。本文旨在探討OptiPrep液富集CTC的可行性,建立一種合理、便捷的分離方法,為實驗室進行常規的CTC檢測和分析奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血樣:取長海醫院血庫健康人外周血10 mL全血30份用于試驗;實體腫瘤患者血樣由東方肝膽外科醫院生物治療科提供,入組患者多為中晚期腫瘤,采血前多接受過手術、放療、化療等相關治療,均已獲得患者知情同意。

1.1.2 人腫瘤細胞株:肝癌細胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7,卵巢癌細胞HO-8910,肺癌細胞A549均來自東方肝膽外科醫院基因與病毒治療實驗室。

1.1.3 試劑與儀器:Hepes(上海博光生物科技有限公司),OptiPrep(Sigma公司),Ficoll(GE Healthcare公司),Viacount(密理博中國有限公司),CD45-FITC(美國BD公司),CFSE(eBioscience公司)。低速臺式大容量離心機(上海安亭科學儀器廠),Guava流式細胞儀(密理博中國有限公司),光學顯微鏡(上海悌可光電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 OptiPrep離心分離外周血

最佳離心條件的確定:離心機使用時選擇慢制動狀態,避免短時加速使各密度梯度細胞發生混雜。將外周血與生理鹽水1∶1混合稀釋,沿壁緩慢加至1.079 g/mL細胞分離液液面上。分別以不同離心轉速分離,記錄不同時間紅細胞沉淀體積。

各層細胞CD45標記流式檢測:密度梯度離心后分別吸取上清液、白膜層和分離液,各取200 uL細胞懸液,加CD45-FITC熒光單抗,輕輕混勻,4℃避光孵育15～30 min,重懸細胞后上機檢測CD45+陽性細胞比例。

1.2.2 篩選OptiPrep分離液最佳密度濃度

3種密度濃度的OptiPrep分離液配制:室溫條件下,將60% OptiPrep原液稀釋至40%工作液,與緩沖液按比例混合,充分混勻后得到3種密度濃度的分離液:1.074、1.079、1.085 g/mL。4℃避光保存。

Viacount試劑盒檢測3種密度濃度的OptiPrep液分離外周血單核細胞的細胞數和細胞活力。

1.2.3 OptiPrep離心分離腫瘤細胞

CFSE熒光標記腫瘤細胞:用PBS等合適的緩沖液調整細胞濃度少于107個/mL;加入1 uL濃度為5 uM的CFSE工作液,輕輕吹打混勻;37℃避光孵育15 min;加入4～5倍體積的完全培養基,冰上孵育5 min;離心后去上清,加入1 mL PBS溶液,再離心后去上清,重復清洗3遍。流式檢測腫瘤細胞CFSE熒光表達。

外周血腫瘤細胞的分離:將帶有熒光標記的腫瘤細胞株QGY-7701加入外周血混勻,以此模擬CTC,密度梯度離心后分別吸取白膜層和分離液,各取200 uL細胞懸液上機檢測CFSE陽性細胞比例。

1.2.4 比較OptiPrep液與Ficoll液的富集效率

將帶有熒光標記的腫瘤細胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7、HO-8910、A549等量加入外周血混勻(1×105個/mL),分別在兩種分離液中密度梯度離心后吸取白膜層,流式檢測富集細胞中CFSE陽性細胞的比例并進行比較。

1.2.5 比較OptiPrep液與Ficoll液的回收效率

由于實際患者血液中CTC數量極少,為檢驗建立的方法是否能夠富集到極少量的腫瘤細胞,逐個挑取了50個左右的單細胞加入5 mL外周血中,密度梯度離心分離進行回收率實驗。單個腫瘤細胞的挑選采用CellEctor Plus細胞分選系統。

極少量腫瘤細胞的富集回收效率:將帶有熒光標記的腫瘤細胞QGY-7701適量加入5 mL外周血混勻(以50個為宜),分別在兩種分離液中密度梯度離心后吸取白膜層,固定細胞后將細胞懸液涂于載玻片上,避光晾干后蓋上蓋玻片,熒光顯微鏡下觀察帶有熒光的細胞即為回收得到的腫瘤細胞,計數并記錄結果。

1.2.6 腫瘤患者循環腫瘤細胞的檢測試驗

患者7.5 mL外周血進行OptiPrep介質分離富集后,結合免疫磁珠純化,將獲得的細胞固定后,進行原位熒光雜交和免疫細胞化學染色以鑒別循環腫瘤細胞。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 OptiPrep離心分離外周血

2.1.1 細胞分層效果的研究

OptiPrep液離心后細胞分層效果明顯,利用不同密度細胞沉降系數的不同能夠有效地富集單核細胞形成云霧狀的白膜層,清晰可見于分離液上層(圖1b)。

OptiPrep液離心條件的優選:外周血密度梯度分離后,在不同時間觀察紅細胞沉淀體積隨著時間的增加而增長,分離液由渾濁逐漸變清,并且比較20 min和30 min沒有顯著差異。同時選取不同離心轉速重復實驗,由表1可見1 600、1 800 r/min離心力較弱,液體分層不明顯,紅細胞沉降體積較少,而1 900 r/min和2 100 r/min的分離效果相似,為保護細胞活性因而選擇1 900 r/min離心20 min為最優條件進行后續分離實驗(表1)。

2.1.2 流式檢測各層單核細胞

流式結果顯示,白膜層中大部分細胞表達CD45+,分離液中僅部分細胞表達CD45+,而上清液中的細胞量很少且均為CD45-細胞(圖2)。

2.1.3 篩選OptiPrep最優密度濃度

從表2可知,外周血中單核細胞數在OptiPrep液密度濃度1.085 g/mL時最多,并隨分離液密度濃度的減少而呈現下降趨勢;同時,3種密度濃度的OptiPrep液獲得的細胞活性率均在90%以上,活力較高。比較分析1.079 g/mL的細胞數量和細胞活性率比1.074 g/mL的有顯著差異(P<0.05),對比1.085 g/mL無顯著差異;細胞活性率1.079 g/mL的最高,并且所有報道中細胞分離液的密度為1.077 g/mL,因而選取1.079 g/mL的OptiPrep液進行后續實驗。

2.2 OptiPrep離心分離腫瘤細胞

選取肝癌細胞株QGY-7701,CFSE標記腫瘤細胞后,流式檢測熒光信號表達為100%(圖3a)。

將帶有熒光的肝癌細胞QGY-7701加入外周血中,模擬外周血分離循環腫瘤細胞,流式檢測CFSE熒光發現,在白膜層中部分細胞表達CFSE,分離液中細胞不表達CFSE(圖3b、c)。

2.3 比較OptiPrep液與Ficoll液的富集效率

2.3.1 不同腫瘤細胞株的比較

將CFSE熒光標記的腫瘤細胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7、HO-8910、A549流式檢測(見圖4),完全陽性表達的細胞以1×105個/mL加入外周血混勻后分離獲取細胞富集層。流式細胞術檢測QGY-7701-CFSE陽性細胞百分比,在OptiPrep液與Ficoll液中分別為4.67%和2.89%,OptiPrep液富集腫瘤細胞的效率高于Ficoll液。其他幾種腫瘤細胞Huh7、SMMC-7721、HO-8910和A549在OptiPrep液中CFSE的陽性細胞百分比為2.07%、3.34%、3.70%、3.50%,均高于Ficoll液中CFSE的陽性細胞百分比1.38%、1.89%、2.52%、2.91%,兩組間差異均有統計學意義。

2.3.2 比較OptiPrep液與Ficoll液的回收效率

單個腫瘤細胞的挑選:由于CTC的稀有性,利用少量腫瘤細胞混入血液模擬外周血循環腫瘤細胞。

借助光學立體顯微鏡直接觀察到目的細胞,通過操作毛細玻璃管吸取單個腫瘤細胞(圖5)。

比較兩種分離介質的腫瘤細胞回收率結果(表3):5次OptiPrep的回收率平均值為84.6%,比Ficoll的81.9%略高(P=0.086),表明OptiPrep分離紅細胞、富集腫瘤細胞的效果與商品化的Ficoll試劑有較好的一致性。

2.4 患者循環腫瘤細胞的檢測

用OptiPrep法對32例腫瘤患者外周血循環腫瘤細胞進行富集,再用抗CD45免疫磁珠進一步去除大量的白細胞,最后通過免疫熒光染色和熒光原位雜交技術對CTC進行鑒定和計數。細胞表型為DAPI+CD45-,并且染色體異常或CK18+的即定義為循環腫瘤細胞。32例患者均檢測到有循環腫瘤細胞,CK18表達陰性的有25例,其中14例肝癌相關的患者均無法檢測到CK18表達(表4)。

腫瘤細胞具有異質性,不同腫瘤以及同一種腫瘤、甚至是同一患者的不同發展階段,其腫瘤細胞表面抗原均會發生變化[10]。本研究聯合了腫瘤細胞表面抗原的免疫熒光染色和染色體的原位熒光雜交技術檢測CTC,從表面標記和染色體異常雙重角度鑒定CTC,相比CellSearch系統單一的表面抗原免疫熒光鑒定方法更具優勢。實際檢驗結果也表明,肝癌中CK18表達很少或不表達,因而本研究采用的雙重鑒定法更能有效預防對CTC的漏檢、錯檢(圖6)。

3 討 論

循環腫瘤細胞(CTC)可作為一種癌癥血源性轉移的生物標記物。現有充分證據顯示CTC的檢測與癌癥的預后相關,在臨床上通過監測CTC評估治療效果,以減少疾病的復發和改善病人的管理,同時對于早期癌癥的發現也有意義[11]。但是,CTC在血液中的含量濃度非常低,數百萬的血液細胞中可能僅有一個腫瘤細胞,而目前的技術對檢測CTC十分困難,因而富集稀有CTC細胞并最大程度地去除血液中其他成分細胞是研究CTC的關鍵。目前最為常用的CTC富集方法是經由FDA批準上市的CellSearch系統,它利用上皮細胞特異性抗原EpCAM陽性篩查CTC,但事實上這一標志物的表達并不穩定,多數惡性腫瘤會發生上皮-間質轉變(epithelial-mesenchymal transition, EMT),甚至約30%的上皮源性腫瘤不表達EpCAM,因而CellSearch方法限定CTC為EpCAM陽性細胞則可能漏檢上皮間質化的腫瘤細胞。密度梯度離心結合免疫磁珠法能很好地避免這一缺陷,而其中分離介質的選擇是密度梯度離心法的關鍵環節。

比較幾種常用的血液分離介質:Percol是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒,價格較低,但很難聚集細胞形成清晰的條帶;Nycodenz為固體,溶解度小,配制復雜且不易控制濃度;Onco-Quick增加了一層濾膜,可避免全血與分離液的混合,但其敏感度低,易造成腫瘤細胞的丟失。選擇OptiPrep液作分離介質是由其為無菌液體,易于稀釋為各種密度濃度,低滲透壓和不穿過生物膜等分子特性決定的。實驗結果顯示,OptiPrep液分離外周血能有效形成云霧狀的單核細胞層,清晰可見于分離液上層。離心后各分層細胞的流式檢測表明,白膜層細胞中CD45標記的白細胞和CFSE標記的QGY-7701腫瘤細胞陽性均較高,而分離液和上清中兩種細胞的陽性率很低甚至為陰性,上清中的細胞量也不多,說明需要富集的單核細胞主要聚集于白膜層中。

多數文獻報道中,外周血分離介質的密度濃度一般為1.077 g/mL。本研究中涉及的3種密度濃度OptiPrep液中,3種密度濃度的OptiPrep液獲得的細胞活性率均在90%以上,活力較高,有助于后期獲取CTC并進行培養研究。比較分析1.079 g/mL的細胞數量和細胞活性率比1.074 g/mL的有顯著差異(P<0.05),對比1.085 g/mL無顯著差異;細胞活性率1.079 g/mL的最高,并且所有報道中細胞分離液的密度為1.077 g/mL,因而選取1.079 g/mL的OptiPrep液作為最佳密度濃度分離外周血CTC。

由于CTC的稀有性,便于更好地收集CTC,使后期的檢測和鑒定實驗相對簡單,需要進一步檢測富集細胞中CTC的純度。通過3種肝癌細胞株和肺癌細胞株以及卵巢癌細胞株混入外周血模擬循環腫瘤細胞,比較OptiPrep液和Ficoll分離液的腫瘤細胞回收實驗,研究發現幾種腫瘤細胞在OptiPrep液中的富集效率均高于Ficoll液。另外,為了更真實的驗證OptiPrep液富集CTC的效率并進行回收率的計算,本研究中用毛細微觀進行單細胞挑取50個左右的腫瘤細胞,混合入血后進行回收率的研究。結果表明OptiPrep分離紅細胞、富集腫瘤細胞的效果較好。

綜上所述,本研究采用OptiPrep液作為分離外周血中循環腫瘤細胞的分離介質,其液體具有配制方便穩定,分層清晰易于獲取細胞,滲透壓低對細胞損傷較小,富集的CTC純度高等優點,建立了一種簡易高效的CTC富集體系。在此基礎上,結合免疫磁珠篩選、染色體原位雜交和表面抗原免疫熒光技術,建立了高效精確的CTC鑒定體系,為進一步研究CTC甚至獲取單個CTC進行分子鑒定奠定了基礎。

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(責任編輯： 許惠兒)

Study on OptiPrep-based Enrichment System of Circulating Tumor Cell

ZHENG Luo-ning1, XU Zeng-hui2, WANG Zhen2, QIAN Qi-jun1,2

(1. School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

This study aimed to establish a simple and efficient enriching method of CTC (circulating tumor cell, CTC) in the peripheral blood. OptiPrep solutions with different concentration was prepared to separate different types of cells in peripheral blood, and the efficiency of enrichment, recovery, and cell viability of OptiPrep solution and Ficoll solution were compared. This system was used to enrich CTC in blood samples of cancer patients. CTC cells were identified in combination of immunomagnetic beads, chromosome fluorescence in situ hybridization and surface antigen immunofluorescence technique. The results show that the optimal separation condition is as follows: OptiPrep density 1.079 g/mL; the centrifugation speed and time 1 900 r/min, 20 min. During CTC examination of blood samples of 32 enrolled cancer patients, it is found that there exist circulating tumor cells. This study demonstrats that OptiPrep-based enrichment system combined with immunomagnetic beads could effectively capture circulating tumor cells in peripheral blood, which flays a foundation for CTC count, culture and other researches in laboratory.

OptiPrep separation medium; density gradient centrifugation; circulating tumor cells; immunomagnetic beads

1673- 3851 (2015) 05- 0699- 07

2014-11-24

國家自然科學基金項目(81071850,81301307)

鄭羅凝(1986-),女,浙江臺州人,碩士研究生,主要從事腫瘤基因治療方面的研究。

錢其軍,E-mail:qianqj@163.com

R73-37

A