基于高通量技術在檢測產褥期婦女陰道微生態的應用

王　黎　盛　巍　張群英

·檢測診斷·

基于高通量技術在檢測產褥期婦女陰道微生態的應用

王黎盛巍張群英

目的 采用高通量16S rDNA測序檢測產褥期及正常婦女陰道微生態，以更好的了解婦女在產褥期的陰道微生態變化。方法 采集產褥期婦女（產后6～8周）及健康育齡婦女的陰道分泌物各5例，采用高通量技術檢測其陰道微生物的種類。結果 陰道微生態菌種在產褥期和正常生育期差異顯著，在正常婦女的陰道中，乳桿菌屬占所有細菌含量的55%，而在產褥期婦女中，占22%。結論 產褥期婦女乳桿菌屬所占比例明顯低于正常生育期婦女，二代高通量測序技術有助于更清楚的了解陰道微生態群落的組成，以進一步了解產褥期婦女陰道微生態狀況，探討產褥期微生態特征，可以為生殖道健康干預、臨床保健工作提供循證依據。

高通量技術 產褥期 陰道微生態菌群

女性陰道微生態體系是由陰道內的微生態菌群、機體的內分泌調節功能和解剖結構共同組成［1］。正常陰道內有多種微生物存在，而且這種微生物生態的形成對阻止一些泌尿生殖系統的疾病發生起著至關重要的作用。產褥期婦女作為特殊群體，其陰道微生態狀況國內外研究較少，基于顯微鏡檢查和傳統的培養法而獲得陰道微生物群落信息多樣性具有嚴重偏差，陰道微生態的評價方法中非細胞培養的基因技術與細菌培養相比有無法比擬的優越性，為了更好的了解婦女在產褥期陰道微生態的變化，本資料通過采集產褥期婦女陰道分泌物，同時隨機挑選正常育齡婦女的陰道分泌物，提取總DNA，擴增得到不同來源的微生物群落16S rDNA序列進行微生物種群分類、群落結構等初步分析。

1　臨床資料

1.1一般資料 采集自2013年9月至2014年11月產褥期婦女（產后6～8周）陰道分泌物5例為觀察組，并隨機選取同時在本院健康體檢育齡婦女的陰道分泌物5例為對照組。所有觀察對象均用長棉簽從陰道側壁上1/3處取得陰道分泌物。觀察組25～38歲，平均33.5歲。對照組年齡21～47歲，平均35歲。月經規律，1個月內無全身應用抗生素及陰道局部用藥，3d內無性生活，并知情同意。納入標準同時滿足以下三項：⑴無臨床癥狀。⑵陰道清潔度Ⅰ～Ⅲ。⑶Nugenf評分0～3分。

1.2方法 （1）檢測：長棉簽采集的微生物檢測pH值、清潔度、膿球、滴蟲、霉菌等。（2）DNA提取：長棉簽采集的微生物懸浮于0.5ml滅菌的PBS溶液中，加入50μl溶菌酶，6μl溶菌素，3μl溶葡球菌酶和41μl TE50緩沖液，37℃消化1h，然后利用細菌基因組試劑盒提取DNA。（3）高通量16S rDNA測序及其數據分析：對細菌的V4區，利用Miseq進行測序，擴增引物為：F：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'，R：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'。擴增體系為50μl。擴增到目的條帶后進行割膠回收，定量后，上機測序。測序所得結果根據不同的Barcode對序列的來源進行分類，采用Flash軟件連接通過質量控制的序列對應的兩端序列，舍棄無連接的序列。對連接上的序列進行過濾，獲得最終序列。應用Qiime，根據序列的相似度，將序列歸為多個OTU。Qiime調用uclust對序列進行聚類，選取每類最長的序列為代表序列。采用blast的方法對silva數據庫進行比對，獲得每個OTU分類學信息。得到每個OTU的分類學信息。OTU產出后，統計各個樣品含有OTU情況及每個OTU中含有序列的數目。

2　結果

2.1陰道微生態狀況 10例就診者中，5例正常育齡婦女陰道微生態正常，5例產褥期婦女中1例外陰陰道假絲酵母菌病，1例為細菌性陰道病。正常育齡婦女組陰道分泌物pH值為（3.72±0.30），產褥期婦女組陰道分泌物pH值為（3.86±0.09），差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2測序情況統計 采用Flash軟件，連接通過質量控制的序列對應的兩端序列。舍棄無法連接的序列。對連接上的序列進行過濾（連續相同堿基＜6；模糊堿基N＜1），獲得最終用于分析的序列。陰道微生態菌種在產褥期和正常生育期差異顯著（P＜0.05）。應用Qiime，根據序列的相似度＞97%的歸為一個OTU。根據OTU的數量和測序得到的序列數，做出每個樣品的稀釋曲線，從圖中發現在產褥期婦女的陰道微生物的種數要明顯多于正常生育期的婦女。為了進一步證明此種種數的差異是否能區分產褥期婦女和正常生育期的婦女，采用偏最小二乘方判別分析（PLS-DA）過濾與模型分類不相關信號即正交信號，獲得PLS-DA模型，兩組樣本已經有較明顯分離趨勢。

2.3產褥期和正常生育期主要的差異菌 健康婦女陰道常駐菌包括乳桿菌、假絲酵母菌、B族鏈球菌等。結果發現，在正常婦女的陰道中，乳桿菌屬占所有細菌含量的55%，而在產褥期婦女中，占22%。此次試驗中主要鑒定到的乳桿菌屬為Lactobacillus iners（正常人35%，產褥期0.8%），Lactobacillus crispatus（正常人8%，產褥期0.2%）和Lactobacillus fornicalis（正常人6%，產褥期0.07%）。

3　討論

本資料采用測定16rsRNA方法對正常女性及產褥期女性的陰道菌群進行檢測，進而全面、準確地獲得陰道菌群的信息，結果顯示，陰道微生態菌種在產褥期及正常生育期差異顯著，其中產褥期婦女乳桿菌屬所占比例明顯低于正常生育期婦女。

陰道菌群非常復雜，常見菌種估計＞500 種，常規細菌培養法僅能檢測10余種病菌，健康育齡女性陰道寄生菌以乳酸桿菌占絕對優勢，本次采用宏基因組學方法測定正常生育期婦女陰道分泌物的檢驗，乳桿菌屬占所有細菌含量的55%，有別于以往所說乳酸桿菌在此微生態系統中約占95%［2］，這要歸功于宏基因組學在陰道微生態的研究應用。

隨著近年來二代高通量測序技術的發展和完善［3］，測序價格亦大幅降低，同時，測序深度也明顯增加，這有助于更清楚的了解陰道微生態群落的組成。與傳統測序技術相比，新一代測序技術平臺無論是測序原理、 測序過程、 適用范圍，還是測序結果均存在本質上的不同，宏基因組學應用于陰道微生態，在國內尚屬領先水平，其檢驗方法的應用可使檢測定植于陰道微生物的種類更為全面、準確。但是，目前尚未廣泛應用于臨床，且本資料選擇樣本數量較少，故可能會影響產褥期微生物菌落的檢測準確性，仍需進一步增加標本量進行研究，以進一步了解產褥期婦女陰道微生態狀況，探討產褥期微生態特征，可以為生殖道健康干預、臨床保健工作提供循證依據。

1 李蘭娟，主編.感染微生態學.北京：人民衛生出版社，2002，421～424.

2 張卓然.臨床微生物學和微生物檢驗.第三版.北京：人民衛生出版社，2003.203～206.

3 盛桂蓮，賴旭東，侯新東.古DNA實驗體系及技術.中國生物化學與分子生物學報，2009，25（2）：116～125.

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2012KYB202）

313100 浙江省長興縣婦幼保健院