微小核糖核酸在缺血性卒中研究中的進展

李海龍，畢曉瑩

微小核糖核酸（micro ribonucleic acids，miRNAs）作為一種小分子（約22個核苷酸）非編碼核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），主要在轉錄后調節相應基因的表達，盡管這種調節機制還未被完全闡明，但目前初步認為它主要通過與目標信使RNA（messager RNA，mRNA）3’端未翻譯的區域完全互補或部分互補地緊密配對結合，進而使目標mRNA退化或者抑制其下一步的翻譯[1]。有研究通過閉塞大鼠右側大腦中動脈模擬短暫腦缺血，發現腦組織和血液均有特異性miRNAs的高表達[2]。另有研究發現，在同樣的模型中，短暫閉塞大腦中動脈及永久閉塞大腦中動脈的大鼠血漿中miR-124濃度在干預后8 h開始升高，24 h達高峰，與假手術組相比升高近150倍，意味著組織損傷特異性的miRNAs可被用來作為缺血性卒中的敏感生物學標記物[3]。而利用miRNAs這種調節基因表達的特性，通過某種傳遞系統減少引起病理損害和異常基因表達的miRNAs，提高發揮有益功能的miRNAs水平，可用于包括缺血性卒中等缺血性疾病的治療[4]。本文對缺血性卒中的病因、診斷、治療、預后等方面中近些年來有關miRNAs的研究進展做一綜述，為miRNAs接下來在臨床上的實踐應用研究提供依據。

1 miRNAs在缺血性卒中高危因素中的作用

缺血性卒中的發生與多種致病因素有關，最常見的原因是頭部或頸部的動脈血管進行性狹窄，這種血管狹窄常由動脈粥樣硬化造成[5]。高脂肪飲食所導致的低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三酯水平升高是動脈粥樣硬化具有顯著意義的危險因素。當腦動脈血管過于狹窄，血細胞便可聚集并形成動脈粥樣硬化斑塊。這些斑塊可以在其形成的部位直接阻斷動脈血管或者脫落后在下游較小的腦動脈處阻塞血管。

組織特異性是miRNAs表達的一個重要特征[6]。有研究對大鼠頸內動脈進行miRNAs微陣列芯片分析，在180個miRNAs陣列中，正常的大鼠頸內動脈中發現了140個，其中有49個miRNAs高度表達[7]。血管內切應力損傷血管內皮細胞進而引起脂質沉積是動脈粥樣硬化形成的重要機制。眾多研究已證實，血管內切應力決定動脈粥樣硬化易發生于血管分叉及彎曲處[8]。有研究報道，血管內切應力可誘發內皮細胞產生miR-21，在內皮細胞中，高表達的miR-21可抑制凋亡基因磷酸酶基因，增強蘇氨酸激酶及一氧化氮合成酶的磷酸化，增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的產生，從而防止內皮細胞的凋亡[9]。miRNAs還參與阻止白細胞的黏附聚集，血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）是由被炎癥因子激活的血管內皮細胞表達的細胞間黏附分子，可通過與白細胞基本表達的α4β1-整合素蛋白相結合黏附于血管內皮細胞，研究發現，miR-126表達的減少可引起VCAM-1的表達增高，且靜息狀態的血管內皮細胞正常表達miR-126[10]，提示miR-126的表達可抑制VCAM-1，進而阻止白細胞黏附于血管內皮細胞，并可能具有抗炎作用。

高脂血癥已被證實是腦血流低灌注和缺血性卒中的重要危險因素。最近的有關miRNAs在調節膽固醇平衡方面的研究顯示，在人類和大鼠的細胞中，miR-33可抑制三磷酸腺苷結合盒轉運子（adenosinetriphosphate-binding cassette transporter，ABCA1）的表達從而減緩膽固醇流向載脂蛋白，因此，在巨噬細胞中，miR-33的高表達和拮抗作用可明顯改變膽固醇的流向，這在過量的膽固醇逆途徑運輸回肝臟的過程中起關鍵作用[11]。在粥樣斑塊的脂質核心形成過程中，miRNAs調節粥樣斑塊相關的巨噬細胞攝取低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）從而轉化為泡沫細胞。研究發現，在被氧化型LDL刺激后的巨噬細胞中，miR-125a-5p可介導其對脂質的攝取并減少一些炎癥因子的分泌釋放（諸如白細胞介素-2、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β）[12]，因此，miR-125a-5p的上述作用可能在防止動脈粥樣硬化進展中發揮重要保護作用。

高血壓病是缺血性卒中的一項顯著危險因素，miRNAs直接參與血管緊張素Ⅱ型1受體基因多態性增強血管緊張素1受體活性的機制并與血壓升高相關聯[13]。有關研究發現，當對人類的主要血管平滑肌細胞使用抑制轉錄的miR-155抑制劑進行轉染，內源性的人血管緊張素Ⅱ型1受體的表達和血管緊張素Ⅱ介導的細胞外調節激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）活性均顯著升高[14]。相關的動物實驗研究顯示，成年高血壓大鼠與正常大鼠相比，主動脈中的miR-155表達減少，且與血壓的水平呈負相關，同時還發現，主動脈中miR-208的表達程度與血壓和年齡均呈負相關[15]，這表明miR-155很可能參與了高血壓病的發展及其病理過程。

2 miRNAs作為缺血性卒中診斷性生物學標記物的研究

目前，卒中的診斷和分型主要依賴于臨床醫師的物理檢查并輔以多種影像學檢查技術作為補充，與急性冠狀動脈綜合征中可檢測肌鈣蛋白、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶作為診斷性生物學標記物不同，由于缺乏快速性、精確性和敏感性的生物學標記物的檢測機制，暫無應用于臨床的卒中相關血漿生物學標記物。來源于各種組織和器官的血漿miRNAs具有很好的穩定性并且可耐受核酸酶的消化和其他惡劣環境，比如煮沸、過高或過低的PH值、長期的存放以及冰凍-融化循環[16]。威斯康星大學的Dharap等[17]對大鼠短暫大腦中動脈阻斷恢復再灌注后在不同的時間點測定miRNAs以了解其功能作用，在恢復灌注后3 h到3 d的5個時間點中，與假手術組相比，所估測的238種miRNAs中有8種表達增多，12種表達減少，且發生變化的miRNAs與多種介導炎癥、神經保護、受體功能和離子平衡的mRNA相關，而加利福尼亞大學的Da-Zhi Liu等[18]對缺血性卒中、腦出血和紅海藻鹽癲癇的大鼠模型造模24 h后測定腦組織和全血中的miRNAs顯示，至少在一種實驗模型中，有5種miRNAs在腦組織和全血中同時上調，4種miRNAs同時下調，更為顯著的發現是miR-298是所有模型造模后唯一在腦組織和血液中均有上調的miRNAs，這與之前的研究中發現短暫大腦中動脈阻斷后腦組織和血液中miR-298同時上調的結果一致[2]。這表明血漿miRNAs可能成為用來診斷卒中的一種具有較高敏感性和特異性的血漿生物學標記物。

有研究得出結論，在年輕卒中患者中，miRNAs的表達明顯受卒中的影響，其表達在卒中病變動脈的大小、卒中類型以及不同的預后結局均不同[19]。一項意在尋找腦梗死中腦組織特異性的miRNAs作為可能生物學標記物的研究發現，在大腦和小腦中分別檢測到了389和395種miRNAs，其中有13種miRNAs的表達具有腦組織特異性，對該miRNAs陣列中信號最強的三種miRNAs進一步分析后顯示，miR-124幾乎在僅在腦組織中表達，在大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occasion，MCAO）大鼠模型中，血漿miR-124濃度在造模后6 h明顯升高，并且在48 h仍有升高，而作為對照的假手術大鼠中miR-124濃度一直在初測值的下限，線性回歸分析顯示大鼠腦梗死面積與血漿miR-124濃度無關聯，因此，miR-124有可是腦梗死的一種生物學標記物[20]。另一項以miR-210作為急性缺血性卒中生物學標記物的研究顯示，與正常健康對照人群相比，急性缺血性卒中患者血液中的miR-210明顯減少，特別是在卒中發生后的7 d和14 d，而且，在卒中患者中，預后較好人群的miRNA-210水平高于預后較差的人群。在該研究隨后的動物學實驗中，miR-210在血液和腦組織中的水平呈正相關。以上研究提示，血液miR-210可能是急性缺血卒中診斷和預后判斷的一種全新的敏感性生物學標記物[21]。此外，血液循環中miR-145也被發現在缺血性卒中的患者中較對照人群有顯著的升高，同樣也值得作為生物學標記物去更深入地研究[22]。如能發現一種或多種血漿生物學標記物，通過在緊急狀態下檢測這種標記物便可對卒中進行診斷、分型甚至預測再發，這將具有極其重要的價值。

3 miRNAs在缺血性卒中治療中的研究進展

缺血預適應（ischemic pre-conditioning，IPC）是以不足以引起大腦缺血損傷所介導的細胞途徑，這種途徑可減少隨后缺血性損傷對腦組織的損害[23]。缺血性卒中發生時有miRNAs表達的變化，一些miRNAs可能具有一定神經保護作用，而對IPC的分析研究可直接揭示miRNAs在神經保護中的作用，進而為尋找缺血性卒中患者新的治療方法提供可能。在一項以IPC與缺血性卒中發生后miRNAs變化作對照的研究中發現，miR-200和miR-182兩大miRNAs家族在腦缺血預適應后3 h選擇性地上調，體外試驗顯示，將8種在體實驗中選擇性上調的miRNAs轉染進小鼠腦神經瘤細胞中后，該細胞的生存能力較對照組增強，提示這些miRNAs具有神經保護作用，其中具有最大神經保護效應的miR-200b、miR-200c和miR-429通過下調脯氨酰羥化酶-2（prolyl hydroxylase 2）水平發揮作用[24]。另一項關于小鼠短暫缺血預適應模型中miRNAs變化及作用靶點的研究顯示，缺血預適應組的miRNAs表達與假手術組、缺血性卒中組及耐受組有差異，預適應所調節的miRNAs主要作用于甲基CpG結合蛋白2（methyl-CpGbinding protein 2，MeCP2）mRNA，而缺血預適應通過減少miR-132表達的同時增加甲基CpG結合蛋白2蛋白，但卻對MeCP2 mRNA水平無影響，敲除MeCP2的小鼠對缺血極為敏感，提示miRNA和MeCP2可成為缺血預適應介導的缺血耐受的效應物[25]。此外，國內首都醫科大學的一項研究對miRNAs在缺氧預適應（hypoxic pre-conditioning，HPC）及MCAO小鼠造模后6 h的表達進行分析后發現，有19種miRNAs通過一系列重要的調節途徑（檸檬酸循環、糖酵解途徑、氧化磷酸化途徑等）對蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）βII、PKCγ和新型PKCε相互作用蛋白進行調節，而這幾種PKC亞型已被證實參與HPC介導的神經保護作用，其中下調miR-615-3p水平可通過調節一種被稱作14-3-3γ的蛋白在HPC介導的神經保護中發揮重要作用[26]。這些研究有助于更好地理解缺血缺氧預適應所介導的耐受機制，尋找新的臨床治療靶點，為缺血性卒中的治療及預防提供新的策略。

有關miRNAs在缺血性卒中潛在治療效應的一系列研究發現，在動物實驗及體外實驗中，通過上調或抑制一些miRNAs的表達進而調節mRNA翻譯表達相應的蛋白質，可起到神經保護及抑制神經細胞凋亡的作用。有研究發現，在體外試驗中，暴露于缺血缺氧環境后，神經元細胞和星形膠質細胞miRNAs的表達種類及隨時間變化各不相同，因此，miRNAs的這種在腦組織缺血后時間性和空間性的表達模式值得更進一步的研究，并有助于促使新的治療干預措施被發現[27]。新加坡國立大學的Sepramaniam等[28]對MCAO大鼠模型中斷1 h供血模擬缺血性卒中，隨即給予側腦室注射miR-320a抑制劑及miR-320a前體，并對水分子通道蛋白-1（aquaporin 1，AQP-1）和AQP-4的表達以及腦組織梗死區大小進行測定，研究結果發現，miR-320a可直接作用于AQP-1和AQP-4的mRNA并可影響缺血條件下AQP-1和AQP-4表達，其中miR-320a前體起抑制作用，而miR-320a抑制劑表現為激活作用，且可明顯減少缺血性卒中后的梗死區面積，提示miR-320a可作為缺血性卒中的潛在治療靶點。其另一項有關miRNAs調節水通道蛋白的研究發現，miR-130a、miR-152、miR-668、miR-939和miR-1280在缺血性卒中星形膠質細胞中高度表達且可調節AQP-4M1亞型啟動子活性，而miR-130a被認為是AQP-4M1亞型的翻譯表達抑制劑，在體實驗的結果顯示，miR-130a抑制劑可上調AQP-4M1亞型mRNA轉錄活性及其蛋白產物，并縮小腦梗死區面積促進梗死的恢復[29]。有關miRNAs神經保護作用的研究還發現，在體實驗和體外實驗中，miR-223可調節羥甲基惡唑丙酸受體亞型GluR2和天門冬氨酸受體（N Methyl D aspartate receptor，NMDAR）亞型NR2B的表達，進而參與調節NMDA介導的海馬神經元中的鈣離子內流和興奮性毒性作用，miR-223不足可引起高水平表達的GluR2和NR2B，促進NMDA介導的鈣離子內流，增加海馬神經元的微小興奮性突觸后電位的產生[30]，這表明miR-233的這種神經保護特點可能成為缺血性卒中的新的治療方法。與miR-233的這種保護作用不同的是，miR-181參與加重缺血性卒中的腦損傷，在小鼠MCAO模型再灌注早期，mi-181水平升高的損傷區域常注定會壞死，而mi-181減少的區域有被挽救的可能，該研究證實，miR-181可能通過抑制一種具有細胞保護作用的分子伴侶——葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）的表達加重神經損傷，減少或阻止miR-181的表達可能具有保護腦功能的作用[31]。

這一系列體內及體外實驗的研究結果均提示，miRNA在調節缺血性卒中發生后神經細胞死亡的一些途徑中具有關鍵作用，通過控制miRNA的表達水平來對缺血性損傷進行干預可能成為未來卒中治療的一項新的治療方法。

4 總結與展望

目前，通過成熟的動物模型和分子生物學檢測技術，很多miRNAs在缺血性卒中中的作用和功能已被有效地認識和識別[32]，同時miRNAs還參與了缺血性卒中的眾多危險因素的發生與形成，循環血中miRNAs較好的理化穩定性使其有理由成為一種可靠的非侵入性的臨床生物學標志物，其通過抑制mRNA的翻譯來調節多種重要蛋白表達的特點為缺血及再灌注的腦損傷治療提供了新的方法對策。現階段，大多數有關miRNAs和卒中的相關研究還主要集中在動物卒中模型和體外試驗中，有關miRNAs的診斷和治療作用的臨床實驗研究期望在不久的將來得到有效地開展。

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