樹突狀細胞腫瘤疫苗研究進展

邵潔　鄒征云　杜娟　蘇舒　劉寶瑞*

樹突狀細胞腫瘤疫苗研究進展

邵潔鄒征云杜娟蘇舒劉寶瑞*

樹突狀細胞（DC）是目前已知體內最強大的抗原提呈細胞（APC），廣泛分布于各種組織器官中，其抗原提呈能力為其他提呈細胞的數百倍，外源性抗原被DC攝取處理或內源性抗原在胞內被加工處理后成為抗原表位肽，并裝載至MHC-I或Ⅱ類分子，遞呈于DC表面，可激活幼稚CD4+T輔助細胞和未接觸過抗原的CD8+細胞毒性T細胞?；贒C的免疫治療，已經被用于產生腫瘤細胞毒性T細胞（CTL），其是對抗腫瘤細胞的有效手段［1～4］。采用患者自身的抗免疫細胞，個體化過繼免疫殺傷腫瘤細胞有望成為有效治療腫瘤的一種方法［5］。

1　DC的分類及免疫學功能

1.1DC的分類 體內的DC主要有兩種來源，即髓源性和血源性。髓源性DC是指由骨髓和臍血中CD34+ 造血祖細胞生成的 DC；而從外周血單個核細胞來源的DC屬于血源性的。目前研究比較成熟且廣泛應用的是髓源性DC，此類DC形態似單核細胞，以CD11C+為表型特征，約占外周血單個核細胞的0.6%。髓源性DC在攝取和處理抗原以及控制免疫反應的啟動中起重要的作用。所有的DC都存在3種不同的分化狀態，即DC前體細胞、未成熟DC和成熟DC，關于不同分類和亞群的DC是否具有相同的DC前體細胞目前尚無統一定論。DC是在骨髓中由CD34+的造血前體細胞在多種細胞因子的作用下分化產生的，GM-CSF、IL-4、IL-3、干細胞因子、FLT3L均直接參與了DC的分化。DC離開骨髓后即成為未成熟DC，未成熟DC低量表達CD83、中等量表達 B7- 1（CD80） 、CD40及ICAM-1（CD54）。而成熟DC表達豐富的MHC- I 類和 MHC-Ⅱ類分子，并高水平表達多種共刺激分子和表面分子如 CD80、CD83、B7- 2（CD86）、LFA-3（CD58）、CD54、ICAM-3（CD50）及CD40［6］。

1.2DC的免疫學功能 人血液和組織中分布的DC均為未成熟DC，未成熟DC捕獲抗原的能力強而刺激T淋巴細胞的能力弱。研究表明，DC有誘導和保護中樞性和周圍性免疫耐受的功能。在無適當共刺激分子的情況下，未成熟DC遞呈組織抗原給T細胞，將導致T細胞無能或清除，未成熟DC的主要功能是捕獲抗原，誘導和保持免疫耐受。成熟DC的主要功能是遞呈抗原和激發免疫反應，并且只有成熟DC才能刺激初始T淋巴細胞并激發免疫反應的發生。DC成熟的重要特征包括MHC-Ⅱ類分子的表達明顯增加并伴有共刺激分子的高表達，以及IL-12等細胞因子的分泌，以有利于刺激T細胞反應。成熟的DC誘導的免疫反應主要以Th1型免疫反應為主。對于腫瘤免疫治療，希望免疫反應能夠向CD4+/CD8+介導的Th1/Tc1型免疫反應方向發展。因此，如果將DC制備成疫苗希望其能夠激發機體產生抗腫瘤免疫反應，那么，DC的成熟狀態就顯得尤為重要。如果使用的是未成熟的DC，結果可能是：不僅不能誘導抗腫瘤免疫反應，還可能誘導對腫瘤抗原的免疫耐受。因此，如何制備出成熟的DC是能否誘導抗腫瘤免疫反應的關鍵問題。

2　腫瘤與DC缺陷

腫瘤與機體免疫之間的相互作用一直是研究和討論的熱點，關于免疫監視為什么不能對腫瘤起作用是研究者普遍關注的問題。由于機體自身遭受免疫抑制、免疫耐受疾病或者自身免疫系統受到破壞導致功能缺陷，從而喪失或者減低其免疫監控的能力，導致機體對惡性病變細胞監控失敗或者免疫忽略，引起APCs細胞功能低下［7，8］。有關人體腫瘤病灶中腫瘤浸潤性樹突狀細胞（TIDCs）的研究充分證明如果荷瘤宿主體內DC的功能缺陷，則其無法攝取吞噬并有效傳遞相關腫瘤抗原，并激發T淋巴細胞識別和殺傷腫瘤細胞的免疫功能。Chaux P等［9］認為，腫瘤逃逸以及宿主免疫系統缺陷是由于CD80、CD86等共刺激分子表達缺陷所造成的。另有學者研究表明，TIDCs或荷瘤宿主的DC有與功能成熟的DC表面分子表達特征完全不同，如MHC類分子及相關共刺激因子低表達或不表達可能是荷瘤宿主體內DC免疫功能缺陷，造成無法激活淋巴細胞的重要原因［10］。Vermi W等［11］研究發現黑色素瘤組織內僅發現數量微少且喪失免疫功能的DC，根本無法有效的激活T淋巴細胞，腫瘤逃逸免疫監視的主要原因很可能與APCs的無能有關；Yanagimoto H等［12］發現胰腺癌患者較正常機體循環血中DC的數量稀少并且難以發揮應有的免疫活性。

最近的研究表明，DC的功能缺陷也是機體對腫瘤細胞不能產生免疫反應重要的因素。DC雖然也常出現在腫瘤組織中或附近，但是常表現為未成熟狀態的DC，這種DC不能遷移至淋巴結。腫瘤細胞釋放的因子，如前所述的VEGF、IL-10以及TGF-β等亦常下調DC激活T淋巴細胞的能力。有研究認為，暴露在這些細胞因子中的DC，常引起不適當的免疫反應，如Th2細胞免疫反應，甚至誘導免疫調節細胞的增加。因此，將DC分離脫離此種環境，在體外培養分化和誘導成熟是體外制備DC疫苗的一種優勢。

3　DC疫苗的制備及促成熟因子

3.1DC的制備 由于DC僅占外周血中極少的一部分，因此要分離和培養DC以獲得治療量的DC一直是制約DC疫苗開展的重要技術關鍵。體外將單個核細胞在GM-CSF和IL-4的誘導下分化為DC的方法成功解決了這一技術難題，使DC能在體外大量培養并達到治療用的劑量。另一類制備DC的方法是由CD34+骨髓前體細胞在GM-CSF和TNF-a等多種細胞因子的誘導下分化而來［13］。有研究報道此類DC與漿細胞DC類似能夠在病毒或者Toll樣受體7刺激物作用下分泌IFN-α。Mohty等［14］通過誘導自噬抑制溶酶體蛋白酶體活性，富集自噬小體，其中包含了各種類型的腫瘤細胞抗原，包括長壽蛋白、短壽蛋白和錯誤編碼、錯誤翻譯等產生的廢蛋白DRiPs。其將這些富含自噬小體的囊泡稱作DRibbls。進一步研究發現雙層膜結構中隔離較多類型抗原，能在體內外高效的交叉激活抗原特異性CD8+T細胞。

3.2促成熟和趨化因子的使用 DC的成熟狀態是決定能否激發免疫反應的關鍵因素。研究發現，多種細胞因子可以促使DC成熟，在體外培養DC的過程中，TNF-a是促成熟常用的一個細胞因子，使用TNF-a制備的DC疫苗對抗腫瘤免疫治療能產生積極的作用。目前采取何種方法促成熟的方案還無統一標準，但是必須引起重視的是，不管如何制備DC疫苗和采取何種促成熟方案，促成熟步驟是必須的，因為只有成熟的DC才能誘導有效的抗腫瘤免疫反應。DC在成熟的過程中，在趨化因子的作用下向二級淋巴器官遷移，后與初始T淋巴細胞作用并啟動免疫反應。若給予PGE2，可增加成熟DC表達CCR7，有利于DC向淋巴結遷移。有研究發現，前2d加入IL-4、GM-CSF共同培養，48h后加入OK432、PGE2聯合INF-a促進成熟，獲得的成熟DC具有更好的誘導CD4+T淋巴細胞向Th1分化，可以分泌更多的IFN-γ；而且成熟的DC具有更好的遷移能力，誘導出更多的細胞毒性T淋巴細胞，發揮更強的殺瘤能力［15］。

4　不同抗原負載模式的DC腫瘤疫苗

4.1腫瘤抗原肽負載疫苗 腫瘤抗原肽（包括合成肽）或腫瘤細胞相關抗原與自身或同種異體的DC共育，DC與腫瘤表位肽結合后，可誘導CD8+CTL及CD4+T輔助細胞的應答及Th1和Th2細胞因子的產生，從而激發機體的抗腫瘤細胞免疫反應。目前已知的抗原肽來源于眾多腫瘤相關抗原（TAA），包括人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）、黑色素瘤抗原、癌胚抗原（CEA）、p53、Survivin、Her-2/Neu等［16］。用腫瘤抗原多肽致敏DC具有較好的靶向性，不易產生自身免疫性疾病。但僅能提供有限的腫瘤抗原表位，MHC限制性的存在，易導致腫瘤細胞免疫逃逸。

4.2腫瘤全細胞抗原負載疫苗 由于目前僅部分腫瘤的相關抗原或特異性抗原已知，大部分腫瘤仍未明確。而腫瘤全細胞抗原含有全部的腫瘤抗原，因而無需明確腫瘤特異性抗原，可提供大量的腫瘤抗原表位，無MHC限制性，因此出現腫瘤細胞逃逸的可能性較小。臨床應用發現安全有效，并可以在晚期轉移性實體瘤患者中達到31.7%（13/41）的臨床獲益［17］。此類抗原包括凋亡壞死腫瘤細胞裂解物或提取物、完整腫瘤細胞等。Palmer等［18］對35例晚期肝癌患者進行Ⅱ期臨床實驗，使用肝癌細胞系HepG2致敏肝癌患者DC，結果顯示疾病控制率（部分臨床反應和病情穩定3個月）為28%。腫瘤全細胞抗原負載的 DC腫瘤疫苗的缺點為含非腫瘤相關抗原量大且種類多，易誘發自身免疫性疾病，所需腫瘤細胞數量多，最佳刺激量難以確定。

4.3腫瘤細胞來源的基因修飾的疫苗 腫瘤抗原編碼基因、細胞因子基因或趨化因子基因導入DC增強了免疫原性，并可在其內持續表達腫瘤抗原，增強了MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ分子遞呈抗原的能力［19］。轉染RNA也可以高效的誘導特異性CTL 細胞的免疫應答，體外研究已在多種腫瘤上證明其有效性［20］。但亦存在運送效率不穩定、技術要求高、蛋白表達不穩定的問題。同時由于正常體細胞抗原表位的存在，致敏DC后能表達MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子及其刺激分子，會使疫苗的抗瘤作用明顯提高。

5　DC腫瘤疫苗聯合應用模式

5.1聯合化療 化療殺滅腫瘤細胞的同時，本身刺激了腫瘤抗原的廣泛釋放，刺激了免疫細胞發揮強大的抗原提呈作用。而小劑量持續化療較之于傳統化療，在殺傷癌細胞的同時，還能影響癌周微環境，抑制新生血管內皮細胞的生長［21］。在小鼠大腸癌模型中，DC疫苗加入FOLFRI方案能夠抑制化療后髓源性免疫抑制細胞（MDSC） 和調節性T細胞（Treg）的反彈，增加CEA特異性Th1和CTL反應，增強抗腫瘤作用。近年的一些臨床前研究發現化療藥，尤其是環磷酰胺，在一定條件下可增強疫苗的免疫反應，目前這一概念已經被引入一些臨床試驗［22］。

5.2聯合放療 由于放療可以引起腫瘤細胞DNA損傷及細胞表型改變，因此也有誘發DC介導的抗腫瘤免疫的潛能。DC行使腫瘤免疫的關鍵在于遞呈腫瘤抗原，放療可引起免疫原性腫瘤細胞死亡，腫瘤抗原釋放增加，無疑增加了DC吞噬并遞呈腫瘤抗原的機會。此外放療也改變了腫瘤細胞微環境，產生活性氧（ROS），引發內質網（ER）壓力，釋放免疫活化細胞因子及趨化因子，釋放損傷相關分子（DAMPs），增強了細胞毒性T淋巴細胞引起的對腫瘤細胞的溶解作用。放療本身可以誘發抗腫瘤免疫，這也可以解釋放療以外的腫瘤消退放療旁觀者效應。因此近年來人們的思維模式已經發生轉變，傾向于在對局部腫瘤實施放療控制負荷以后，加以額外的免疫治療強化、保障放療之后的抗腫瘤免疫反應。

5.3聯合其他免疫治療 目前已知，血管內皮生長因子（VEGF）通過抑制腫瘤抗原呈遞封鎖髓系DC分化和成熟，導致腫瘤的免疫耐受，而抗VEGF治療則可以減少CD4+CD25+Treg細胞數，增加CTL生成，增強疫苗作用。一項針對血清學復發的前列腺癌患者的研究已經證實疫苗和貝伐單抗聯合應用可以誘導高免疫反應［23］。貝伐單抗還可能通過促進T細胞向腫瘤歸巢改善疫苗功能，已經有將DC疫苗聯合貝伐單抗合應用于臨床的Ⅰ期研究。CTLA-4與B7分子結合后誘導T細胞無反應性，參與免疫反應的負調節。在結腸癌小鼠模型中發現聯合CTLA-4封鎖和耗竭CD25+Treg，可增強DC疫苗的腫瘤免疫。

6　展望

近年來，應用DC腫瘤疫苗治療腫瘤，被廣泛研究并部分應用于臨床治療，取得了一定的成績。當然，要使DC腫瘤疫苗真正成為臨床上能廣泛應用的腫瘤疫苗還面臨著各種桃戰，未來還需要針對腫瘤特殊的免疫抑制環境，整合DC疫苗以及其他的免疫治療模式，形成更強大的腫瘤免疫治療組合。

1Kalinski P，Okada H.Polarized dendritic cells as cancer vaccines： directing effector-type T cells to tumors.Semin Immunol，2010，22（3）：173～182.

2Steinman RM. Decisions about dendritic cells： past， present， and future. Annu Rev Immunol， 2012，30（3）：1～22.

3Barth RJ，Fisher DA，Wallace PK，et al.A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients：tumor-specific immune responses are associated with improved survival. Clin Cancer Res，2010，16（22）：5548～5556.

4Lesterhuis WJ， De Vries IJ， Schreibelt G， et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigenspecific T cells in advanced melanoma patients. Clin Cancer Res，2011，17（17）：5725～5735.

5Ma Y，Zhang Z，Tang L，et al.Cytokine-induced killer cells in the treatment of patients with solid carcinomas： a systematic review and pooled analysis. Cytotherapy， 2012，14（4）：483～493.

6MailliardRB，DallalRM，Son YI，et al.Interleukin-18（IL-18）Synergizes with IL-2 to Enhance Cytotoxicity，Interferon -Production，and Expansion of Natural Killer Cells.ImmunolInvest，2000，29（2）：177～185.

7Lipscomb MF， Masten BJ. Dendritic cells： immune regulators in health and disease. Physiol Rev，2002，82（1）：97～130.

8Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance. Nat Rev Cancer，2005，5（4）：263～274.

9Chaux P，Moutet M，Faivre J，et al.Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinomas express HLA class Ⅱ but not B7-1 and B7-2 costimulatory molecules of the T-cell activation.Lab Invest，1996，74（5）：975～983.

10Troy A，Davidson P，Atkinson C，et al.Phenotypic characterisation of the dendritic cell infiltrate in prostate cancer.J Urol，1998，160（1）：214～219.

11Vermi W，Bonecchi R，Facchetti F，et al.Recruitment of immature plasmacytoid dendritic cells （plasmacytoid monocytes） and myeloid dendritic cells in primary cutaneous melanomas.J Pathol，2003， 200（2）：255～268.

12Yanagimoto H， Takai S， Satoi S， et al. Impaired function of circulating dendritic cells in patients with pancreatic cancer.Clin Immunol，2005，114（1）：52～60.

13Farkas A，Kemény L.Interferon-α in the generation of monocytederived dendritic cells：recent advances and implications for dermatology. Br J Dermatol，2011，165（2）：247～254.

14Mohty M，Vialle-Castellano A，Nunes JA，et al.IFN-alpha skews monocyte differentiation into Toll-like receptor 7-expressing dendritic cells with potent functional activities. J Immunol，2003，171（7）：3385～3393.

15Sakakibara M， Kanto T， Inoue M， et al. Quick generation of fully mature dendritic cells from monocytes with OK432， low-dose prostanoid，and interferon-alpha as potent immune enhancers.J Immunother，2006，29（1）：67～77.

16Nencioni A，Grünebach F，Schmidt SM.The use of dendritic cells in cancer immunotherapy.Crit Rev Oncol Hematol，2008，65（3）：191.

17Kamigaki T，Kaneko T，Naitoh K，et al.Immunotherapy of autologous tumor lysate-loaded dendritic cell vaccines by a closed-flow electroporation system for solid tumors. Anticancer Res，2013，33（7）：2971～2976.

18Palmer DH， Midgley RS， Mirza N. A phase Ⅱ study of adoptive immunotherapy using dendritic cells pulsed with tumor lysate in patients with hepatocellular carcinoma. Hepatology，2009，49（1）：124～132.

19Dougan MG， Dranoff.Immune therapy for cancer. Annu Rev Immunol， 2009，27： 83～117.

20Hobo W，Strobbe L，Maas F，et al.Immunogenicity of dendritic cells pulsed with MAGE3， Survivin and B-cell maturation antigen mRNA for vaccination of multiple myeloma patients. Cancer Immunology Im munotherapy，2013，62（8）：1381～1392.

21Pasquier E，Kavallaris M，André N. Metronomic chemotherapy： new rationale for new directions. Nat Rev Clin Oncol，2010，7（8）：455～465.

22Chu CS，Boyer J，Schullery DS，et al. Phase Ⅰ/Ⅱ randomized trial of dendritic cell vaccination with or without cyclophosphamide for consolidation therapy of advanced ovarian cancer in first or second remission. Cancer Immunol Immunother，2012，61（5）： 629～641.

23Rini BI，Weinberg V，Fong L，et al. Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells（provenge）plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy. Cancer， 2006，107（1）： 67～74.

210008 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腫瘤中心