老年性耳聾發病機制及基因修復治療進展

黃海林　劉俊*

老年性耳聾發病機制及基因修復治療進展

黃海林劉俊*

老年性耳聾又稱為年齡相關性耳聾［1］，是一個復雜的退行性疾病，是哺乳動物衰老后在聽覺器官表現的一種普遍現象。主要特點表現為隨著年齡增長逐漸發生的雙側緩慢進行性耳聾，其聽力下降主要為高頻聽力下降為主的感音神經性聽力損失，同時伴有言語識別力差，尤其在噪聲環境中，中樞對聲音信息的加工過程緩慢，對聲音的定位能力下降等。在老年性耳聾的發展過程中，伴隨發生多種分子理化功能改變，導致DNA損傷的增加和線粒體功能下降。本文著重介紹老年性耳聾與線粒體DNA突變、線粒體氧化損傷的關系及其相關基因的修復作用并做一簡要綜述。

1　老年性耳聾

老年性耳聾發病率在全球范圍內持續增長。據美國公共衛生署統計，＞75歲的老年人約40%～66%有聽力損失，而＞80歲的老年人＞80%有聽力損失［2］。在我國，老年性耳聾已成為聽力殘疾的首要因素，根據最近2006全國第二次殘疾人口普查，全國＞60歲老人中殘疾人有4420萬，其中聽力殘疾老年人占34.59%，占聽力殘疾總人口76.87%。由于耳聾，老年人不愿意與人交流溝通，使得性格逐漸變得急躁、孤僻，身心健康受到嚴重影響，嚴重時可能誘發老年性抑郁甚至引起癡呆癥。老年性耳聾不僅會嚴重影響老年人群的生活質量，還會影響周圍健康人群的生活，給家庭和社會帶來沉重的負擔。但到目前為止，老年性耳聾的相關機制尚未完全闡明，目前尚缺乏切實、有效的防止手段。因此大多數學者致力于闡明老年性耳聾發病的分子機制，并且在此基礎上進行基因水平的防治研究。

2　老年性耳聾的病理改變及臨床分類

老年性耳聾的發生發展與眾多分子、生化和生理變化有關，包括線粒體DNA損傷增加和線粒體功能下降。老年性耳聾的病理變化主要涉及血管紋、耳蝸毛細胞、傳入神經通路、聽覺傳出神經通路、耳蝸螺旋神經元以及聽覺中樞皮層的退變。但是，大多數學者認為，內耳耳蝸毛細胞和螺旋神經節的退變是老年性耳聾的關鍵。其具體病理變化主要包括4個方面［3］：（1）耳蝸內外毛細胞萎縮變性，同時伴隨支持細胞的減少。（2）耳蝸螺旋神經節細胞、神經纖維退變及變性。（3）血管紋基底膜增厚、鈣化、變性導致彈性減退引起能量傳導減少且ATP產生不足。（4）聽覺中樞相對應核團細胞萎縮、減少及神經纖維變性。根據老年性耳聾患者耳蝸的生理、病理學改變，情況將其分為四類型［4］：（1）感音性老年性耳聾：病理改變主要以毛細胞損傷為主，聽力表現以高頻聽力下降為主。（2）神經性老年性耳聾：病理表現以螺旋神經節和聽神經纖維萎縮減少和退行性變為特征，聽力表現為言語識別及鑒別能力降低。（3）血管紋性老年性耳聾：主要表現為血管紋萎縮，聽力曲線為平坦型，但言語識別率尚正常。（4）傳導性老年性耳聾：其病變為內耳基底膜增厚和彈性減弱，聽力曲線表現為高頻區下降明顯但言語辨別率相對較好。后來Katsarkas等［5］研究發現僅50%的老年性耳聾個體是符合單純Schuknecht分類，其他多屬于混合型老年性耳聾：其病理表現在光鏡下有多種病變，臨床上聽力曲線為平坦型或陡峭型為主，此外后來學者又發現并新增了未定型老年性耳聾：其病理改變與聽力曲線無相關性。

3　老年性耳聾與衰老氧化損傷的關系

老年性耳聾是由多種危險因子的長期累積共同作用的結果，其致病因素包括年齡、遺傳、環境以及自身健康（高血壓、糖尿病等），其中衰老是最重要的危險因子。根據Harman提出衰老的自由基學說，認為衰老是由自由基引起的組織隨機毒害的結果，自由基損害作用的機制主要涉及DNA的損傷，尤其是線粒體DNA（mtDNA）的氧化損傷，其持續產生于線粒體電子傳遞鏈的活性氧簇（ROS）是衰老過程中線粒體DNA氧化損傷產生的主要原因［6］。

線粒體是細胞的能量工廠，通過氧化磷酸化產生ATP給細胞供能，同時又產生具有毒性作用的副產物活性氧。正常情況下，機體為了應對活性氧的氧化壓力，會調節自身體內抗氧化系統對抗氧化反應，清除ROS。但隨著機體的衰老，不斷累積的ROS超過了細胞自身的抗氧化解毒作用，細胞內的氧化還原平衡被打破，加上由于mtDNA暴露在高濃度的氧自由基環境下，缺乏組蛋白保護，因此mtDNA的突變率較核DNA高10～20倍［7］；另一方面，機體自身修復機制比較簡單，DNA自我修復酶活性下降，導致其更易受到ROS的損傷，ATP產生不足，線粒體功能紊亂，最終導致不可逆聽力損失［8］。正常生理情況下，體內存在對ROS的防御機制如抗氧化酶、抗氧化劑、氧自由基清除劑如維生素C、維生素E、輔酶Q10和α-硫辛酸以及DNA修復系統來對抗自由基氧化作用，當機體產生ROS時，其可以及時清除細胞代謝產生的自由基，從而保護細胞免受損傷。但機體處于衰老狀態時，因抗氧化物酶活性下降以及自身DNA堿基切除修復（BER）的衰退，導致大量ROS不能完全被清除而在機體中積累下來。不斷累積的ROS破壞生物膜產生丙二醛（MDA），同時超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性隨著年齡增長而降低，所以一般用MDA、SOD、GPX作為反映老化的指標［9］，反映機體氧化損傷的程度。

4　線粒體DNA缺失與老年性耳聾的關系

老年性耳聾是常見的老年性疾病之一，但老年性耳聾的機制仍不清楚。一般認為ROS通過損傷線粒體，使得核區和線粒體內的DNA發生突變和缺失，這些缺失和突變在細胞、組織及機體的老化和退行性變中起主要作用，成為老年性耳聾重要的致病因素之一［10］。許多研究表明，線粒體DNA缺失突變和人類老年性耳聾關系密切。其中線粒體DNA 4977 bp是線粒體DNA中最常見的缺失片段（大鼠相應為線粒體DNA4834bp），又被稱為線粒體DNA常見缺失（CD）［11］。此缺失突變不僅存在于衰老組織中，還可存在于線粒體腦肌病、進行性眼外肌麻痹和Kearns-Sayre綜合征等疾病中，且隨著年齡增加在組織中逐漸積累［12］。

CD片段編碼包含泛醌氧化還原酶亞單位Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（ND3、ND4、ND5），細胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ（COXⅢ），全部ATP合成酶亞單位Ⅵ（ATP6），部分ATP合成酶亞單位Ⅷ（ATP8）等，均是氧化磷酸化及電子傳遞過程的主要部位，造成一系列病理改變，導致老年性耳聾。有學者認為線粒體DNA4977bp缺失突變發生后，可導致呼吸鏈酶蛋白合成障礙、線粒體氧化磷酸化功能降低、ATP生成減少，內淋巴液離子失平衡，動靜電位差平衡失調，最終內環境紊亂，毛細胞發生非特異性損害，引起聽力下降［13］。從最早Seidman發現老年性耳聾患者的顳骨標本中存在mtDNA4977缺失，而在聽力正常的老人顳骨標本中，未發現類似缺失［14］，提示老年性耳聾與此突變有密切關系。近期，Markaryan等［15］應用長片段PCR的方法，在人類顳骨火棉膠切片中成功檢測出了線粒體DNA4977bp缺失突變和其他幾種線粒體DNA缺失突變的存在，并認為缺失突變和聽力下降有關，其發現老年性耳聾患者的顳骨標本中普遍缺失的平均缺失突變率為32%，而相同年齡的正常人的缺失突變率為12%，表明線粒體突變只有累積到一定程度機體才會表現出老年性耳聾，驗證了線粒體DNA的閾值效應。同時劉紅［16］在檢測老年性耳聾患者毛干中MtDNA4977bp突變率時發現，重度耳聾患者線粒體DNA缺失量為（33.68±10.30）%，輕度耳聾患者線粒體DNA缺失量為（11.97±4.12）%，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。在動物實驗研究中，劉俊等［17］觀察了老年大鼠耳蝸螺旋神經節及耳蝸核MtDNA 的缺失，發現mtDNA4834 片段缺失率為66.7%和100%，在青年大鼠中并不出現mtDNA4834 的缺失，從而支持了 mtDNA 片段缺失與老年性耳聾發生有關的學說。以上研究均表明mtDNA常見缺失突變與老年性耳聾密切相關，因此被研究者考慮作為衰老標志物。但是并非所有老年性耳聾患者都有mtDNA4977，部分聽力正常者甚至年輕人群也可檢測出mtDNA4977缺失突變。說明線粒體普遍缺失突變在老年性耳聾中的具體機制有待于進一步的研究。

5　線粒體DNA突變的修復及預防

根據衰老的自由基學說，生物體衰老主要來源于機體代謝活動中產生的ROS，此過程是正常的衰老過程，是無法避免的。但可以通過減少和預防DNA突變的發生，來避免ROS堆積對細胞功能造成的危害。避免DNA突變積累的有效機制就是DNA修復。線粒體DNA修復機制包括：堿基切除修復（BER）、核酸切除修復和錯配修復等，其中以BER最為重要。DNA聚合酶γ（DNA polγ）和8-氧鳥嘌呤糖苷酶（8-OGG1）是線粒體DNA堿基切除修復過程中兩個主要的修復酶。線粒體DNA聚合酶γ是動物線粒體內唯一的DNA聚合酶，不僅具有核苷酸聚合功能，還具有校正讀碼（但校正能力不足），及時糾正DNA在復制過程中出現堿基插入錯誤的功能。人類8-羥基鳥嘌呤DNA 糖苷酶（8-hOGGl）蛋白是hOGGl基因的編碼產物，其主要功能是識別線粒體氧化損傷引起8-氧鳥嘌呤（8-oxoG）堿基修飾改變，并切除DNA雙鏈中的8-OHdG，對DNA進行特異性的修復。Yuzefovych LV等［18］研究hOGGl基因表達水平不同的轉基因小鼠，發現hOGGl基因表達的改變，可以影響DNA氧化損傷的修復，尤其是mtDNA的修復。Torres-Gonzalez M等［19］構建OGGl腺病毒載體細胞時發現Adv-OGGl過表達時能增強mtDNA修復能力，提高細胞活性，并認為OGGl為mtDNA氧化損傷突變修復中的主要限速酶和調節酶類。因此，hOGG1有望成為未來干預老年性耳聾的重要因素之一，可以為以后基因治療老年性耳聾提供理論依據。此外，不少學者提出通過提高機體清除ROS能力，保護抗氧化酶系統，維持正常生理功能，來預防老年性耳聾的發生。Seidman等［20］發現通過應用抗氧化劑，限制能量的攝入可以延緩年齡相關的聽力損失進展。孔維佳等［21］學者通過實驗表明α-硫辛酸、維生素E、輔酶Q10對大鼠可以顯著降低大鼠線粒體DNA 4834 bp缺失突變的發生率，對線粒體DNA有明確的保護作用。

6　展望

本文總結了線粒體DNA缺失突變和ROS對線粒體功能氧化應激損傷在老年性耳聾發展過程中的作用，認為ROS對線粒體氧化損傷以及線粒體DNA常見缺失（CD）在老年性耳聾的發展進程中扮演了重要角色。而且相關動物實驗表明DNA聚合酶γ（DNA polγ）以及8-OGG1可以識別線粒體DNA基因突變并進行修復，為基因治療老年性耳聾提供了理論基礎。目前基因治療老年性耳聾還局限于理論及動物實驗階段，尚未成熟。常見的治療基因有Math1基因、Atoh1基因、神經生長因子、肝細胞生長因子等。其中Math1基因研究最多，有學者將Math1基因經過腺病毒介導轉染至成年耳聾模型鼠，發現耳蝸Corti器有新生毛細胞再生，且呈現正常定位和形態，通過聽性腦干反應測試發現轉染組聽力較對照組大幅度提高［22］。另外Zhao Han等［23］研究發現將Atoh1基因傳染神經干細胞后將其移植至豚鼠耳蝸，移植細胞在活體耳蝸內存活，且可以正常分化為毛細胞并可使豚鼠恢復部分聽力。由于老年性耳聾的基因致病機制復雜，而且面臨諸多技術、經濟、倫理問題，基因治療技術還有待研究。相信隨著分子生物學技術的飛速發展，干細胞、基因治療必將取得突破，其它針對老年性耳聾的干預措施也會不斷進步，可以有效防治老年性耳聾，老年性耳聾患者生活質量將會明顯改善。

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310053 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院（黃海林）310006 浙江中醫藥大學附屬第一醫院（劉俊）