多發(fā)性腸系膜靜脈栓塞患者易栓癥的類型與遺傳相關(guān)性

喬曉亮

（鄭州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，河南　鄭州　450003）

多發(fā)性腸系膜靜脈栓塞患者易栓癥的類型與遺傳相關(guān)性

喬曉亮

（鄭州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，河南鄭州450003）

通過(guò)對(duì)多發(fā)性腸系膜靜脈栓塞患者及其家系進(jìn)行相關(guān)檢查和基因診斷得出，易栓癥相關(guān)檢測(cè)結(jié)果及基因序列突變分析，患者與其弟弟有車禍外傷史等獲得性誘因存在，但兩患者間不存在AT基因突變，診斷為獲得性易栓癥。

多發(fā)性靜脈血栓；易栓癥；遺傳基因

1　資料與方法

1.1一般資料

患者（Ⅱ2），男，漢族，32歲，于2008年因車禍致左側(cè)髂骨及盆腔骨折，經(jīng)術(shù)后休養(yǎng)，隨后出現(xiàn)腹痛等癥狀，經(jīng)血管造影與CT等檢查診斷為腸系膜靜脈血栓。于2012年底因右側(cè)腹部劇烈脹痛再次入院治療，行剖腹探查，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸段腸系膜出現(xiàn)血栓栓塞。術(shù)后行溶栓治療，出院后給予華法林維持治療半年，每月監(jiān)測(cè)凝血機(jī)制一次。患者弟弟（Ⅱ3），男，漢族，28歲，同在2008年車禍中導(dǎo)致兩根肋骨骨折，2009年出現(xiàn)下肢腫脹疼痛，經(jīng)多普勒彩超和CT檢查發(fā)現(xiàn)右下肢存在靜脈栓塞。該家系其他成員無(wú)靜脈血栓史。

1.2相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)

經(jīng)所有成員同意后，對(duì)該家系成員（7人）分別采用靜脈穿刺采集外周血，并留取晨尿標(biāo)本各10 mL。干燥管及枸櫞酸鈉抗凝管血液樣品，立即3000 r/min離心10 min。尿液樣本進(jìn)行尿液分析，血樣進(jìn)行PT、APTT、TT及FIB凝血四項(xiàng)、血液細(xì)胞分析和D-D二聚體檢測(cè)、蛋白C的活性（PC:A）和蛋白S的活性（PS:A）以及AT的活性檢測(cè)、血糖、肝腎功能、狼瘡抗凝物（LA）及抗心磷脂抗體檢測(cè)等。

1.3Western blot檢測(cè)血漿中AT含量

從-80℃冰箱取出枸櫞酸鈉抗凝凍存的血漿，并將該家系7位成員的血漿用磷酸鹽緩沖液稀釋20倍，與上樣緩沖液3：1混合，放到100℃沸水中煮沸5 min，使蛋白變性為蛋白單體。然后進(jìn)行蛋白電泳（10%SDS-PAGE，60V，55 mA）3.5 h，再經(jīng)濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜電泳（60 V，160 mA）3 h，使電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。以5%牛奶粉脫脂溶液（脫脂奶粉0.5 g，TBST 10 mL）封閉2 h，徹底洗凈，用抗AT的一抗孵育過(guò)夜（4℃），經(jīng)清洗后用二抗孵育2 h。經(jīng)過(guò)徹底清洗后用DAB顯色液顯色15 min。同時(shí)進(jìn)行-actin的內(nèi)參照顯色，陽(yáng)性條帶呈現(xiàn)棕色后加蒸餾水洗滌。圖像采集使用美國(guó)ALPHA凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。采用彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker（11-180kD）標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量。

1.4全基因組DNA抽提

取該家系7位成員外周血（枸櫞酸鈉抗凝）各200 uL，提取試劑盒選用歐盟Fermentas DNA提取全基因組DNA，按說(shuō)明規(guī)范操作。

1.5PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

AT基因的7個(gè)外顯子的擴(kuò)增引物序列參照文獻(xiàn)報(bào)道［1］，并使用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)［2］。PCR總體系為25 uL：引物終濃度為0.2 umol/L，模板DNA 50 ng，Taq酶為1.25U（北京TIANGEN），dNTP終濃度為0.25 mmol/L，MgCl2終濃度為1.5 mmol/L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，而后95℃30 s，57℃退火30 s（如此反復(fù)實(shí)驗(yàn)，第3外顯子采用62℃退火，第5外顯子采用60℃退火），72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物80ul，加入20 uL樣緩沖液（loading buffer）（4:1）混合，進(jìn)行瓊脂糖電泳（18 g/L瓊脂糖，含溴化乙錠）30min，應(yīng)用美國(guó)ALPHA凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。將患者相應(yīng)電泳條帶在254 nm紫外燈下切取，進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收、純化采用QIAquick Extracion Kit試劑盒。

1.6AT基因測(cè)序及突變分析

PCR純化后產(chǎn)物，進(jìn)行正反向測(cè)序。患者AT基因測(cè)序后的結(jié)果，使用BLAST在線工具與美國(guó)國(guó)家生物信息中心公布的AT基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行基因突變分析。

1.7排除FV Leiden突變和凝血酶原G20210A突變

對(duì)患者進(jìn)行FV Leiden突變檢測(cè)：引物選用F，5’CCATTATTTAGCCAGGAGACC3’，R，5’ATTGGTTCCAGCGAAAGC3’；除此之外，對(duì)外顯子10以及側(cè)翼序列擴(kuò)增（60℃退火）和測(cè)序分析。并同時(shí)進(jìn)行對(duì)凝血酶原G20210A突變檢測(cè)：引物采用F，5’TCTAGAAACAGTTGCCTGGC3’，R，TCCAGTAGTATTACTGGCTC3’；對(duì)外顯子14以及側(cè)翼序列擴(kuò)增（53℃退火）和測(cè)序分析。

2　結(jié) 果

2.1檢測(cè)結(jié)果

患者（Ⅱ2）檢測(cè)結(jié)果：AT：A 49%，PC：A 125%，PS：A 117%，PT 11.9s，INR 0.99，APTT 40.7 s，TT 15.5 s，F(xiàn)IB 2.89 g/L；血液細(xì)胞分析、肝腎功能等無(wú)明顯異常，血糖、尿液分析、D-D二聚體、狼瘡抗凝物、抗心磷脂抗體、同型半胱氨酸等檢測(cè)結(jié)果均正常。患者（Ⅱ3）檢測(cè)結(jié)果：AT：A 45%，PC：A 97%，PS：A 126%，其他檢查正常。該家系7人中有2人表現(xiàn)為AT:A的降低，而其他成員的AT、蛋白C和蛋白S活性等檢測(cè)結(jié)果均正常。

Western blot檢測(cè)結(jié)果與AT抗原含量檢測(cè)一致，僅表現(xiàn)為AT活性降低。

2.2測(cè)序結(jié)果及突變分析

將患者AT基因7個(gè)外顯子測(cè)序后的結(jié)果與AT基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)和分析；用BLAST工具將測(cè)序序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列，與美國(guó)國(guó)家生物信息中心公布的AT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，均未發(fā)現(xiàn)AT基因突變位點(diǎn)和氨基酸序列異常。

2.3FV Leiden突變和凝血酶原G20210A突變分析

對(duì)患者（Ⅱ2）的FV基因的第10外顯子及凝血酶原基因的第14外顯子進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)序和PCR擴(kuò)增，未發(fā)現(xiàn)以凝血酶原G20210A突變及FV Leiden突變。

3　討 論

該家系兩個(gè)患者AT基因測(cè)序結(jié)果顯示：患者（Ⅱ2）與患者（Ⅱ3）的PC:A、PS:A檢測(cè)均正常可排除PS和PC蛋白異常的影響，肝腎功能、血糖、凝血四項(xiàng)、抗心磷脂抗體、LA、同型半胱氨酸和D-D二聚體等均正常可排除其他疾病的影響［3-4］，經(jīng)基因突變分析未發(fā)現(xiàn)AT基因突變、凝血酶原G20210A突變和FV Leiden突變，僅有AT:A活性降低，而患者有骨折史、手術(shù)史是獲得性易栓癥發(fā)病的重要誘因。術(shù)后予患者抗凝、溶栓治療2周，好轉(zhuǎn)后每月監(jiān)測(cè)一到三次凝血機(jī)制，出院后繼續(xù)適當(dāng)服用抗凝藥物適量進(jìn)行預(yù)防性用藥半年［5］。

本文為獲得性易栓癥與遺傳性易栓癥的鑒別診斷提供了參考，為今后易栓癥的深入相關(guān)研究提供了病例資料。

［1］ 張紅媛，王謝桐.易栓癥相關(guān)自身抗體的研究進(jìn)展［J］.中華產(chǎn)科急救電子雜志，2014（02）:70-72.

［2］ 李正民，呂金利，方盼盼，等.抗凝血酶基因10381T缺失導(dǎo)致的Ⅰ型抗凝血酶缺乏癥.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，05（03）.

［3］ 王謝桐，李善玲.孕產(chǎn)期易栓癥與肺栓塞的診治［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2013（02）:16-23.

［4］ 張 蕾，付錦華，曹雙元.血中狼瘡抗凝物的含量與自然流產(chǎn)的關(guān)系［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2011（01）:17-18.

本文編輯：徐 陌

Type and genetic correlation of embolism in patients with multiple mesenteric venous thrombosis

QIAO Xiao-liang
（Maternal and child health care hospital of Zhengzhou City，Henan Zhengzhou 450003，China）

R657.2

B

ISSN.2095-6681.2015.24.116.02

喬曉亮（1982-），男，河南安陽(yáng)人，本科，主管檢驗(yàn)師，研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)