轉化生長因子-β1在丹紅改善早期慢性腎臟病大鼠腎臟病理損傷中的作用

楊青梅　沈穎婧　 鮑曉榮　史繼敏　張繼紅

(復旦大學附屬金山醫院a腎內科，b中心實驗室，上海　201508)

·論著·

轉化生長因子-β1在丹紅改善早期慢性腎臟病大鼠腎臟病理損傷中的作用

楊青梅a沈穎婧a鮑曉榮a史繼敏b張繼紅b

(復旦大學附屬金山醫院a腎內科，b中心實驗室，上海201508)

摘要目的：探討中藥丹紅對早期慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)大鼠腎臟病理損傷的療效及TGF-β1在其中的作用。方法： 將30只雄性SD大鼠隨機分為模型組、對照組和干預組，每組10只。3組大鼠分別給予單側腎切除建立早期CKD模型、假手術(逐層分離組織至腎包膜，但不做腎切除)和建立早期CKD模型后丹紅干預。觀察各組大鼠腎臟病理改變、24 h尿蛋白量和腎功能，分別采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫組織化學法檢測腎皮質中轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)濃度和腎組織總TGF-β1表達情況。結果：與對照組相比，模型組大鼠腎小球輕中度系膜細胞增生伴局部系膜基質增寬、球囊壁粘連及毛細血管壁改變，腎小管間質存在不同程度炎性細胞浸潤與間質纖維化；與模型組比較，干預組大鼠腎臟病變明顯減輕；模型組的腎臟病理總積分高于對照組(P<0.05)，而干預組低于模型組(P<0.05)。模型組與干預組24 h尿蛋白量高于對照組(P<0.01)，干預組24 h尿蛋白量低于模型組(P<0.01)。3組血肌酐、尿素水平無顯著差異，但模型組和干預組血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑濃度較對照組明顯增高(P<0.05)。模型組大鼠腎皮質TGF-β1濃度和腎組織總TGF-β1表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，干預組兩者均低于模型組 (P<0.05)。腎組織TGF-β1表達與尿蛋白量、腎臟病理損傷總積分均有顯著相關性(P<0.01)。結論：丹紅能通過下調TGF-β1表達改善早期CKD大鼠腎臟病理病變。

關鍵詞慢性腎臟病；轉化生長因子-β1；丹紅

中圖分類號R692

文獻標識碼A

Role of Transforming Growth Factor β1 in Improving Renal Pathological Lesions of Rats with Early Chronic Kidney Disease withDanhongYANGQingmeiaSHENYingjingaBAOXiaorongaSHIJiminbZHANGJihongb

aNephrologyDepartment,bCentralLaboratory,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China

AbstractObjective：To explore the efficacy of traditional chinese medicineDanhongon renal pathological lesions of rats with early chronic kidney disease (CKD) and the role of transforming growth factor β1(TGF-β1) in it. Methods:Thirty male SD rats were divided into three groups: the early CKD group (model group), the sham-operated group (control group) andDanhongtreated group (treated group), with 10 in each group. Rats in the three groups were treated by uninephrectomy for building up early CKD model, sham-operation (separating tissues to renal capsule without kidney excision), andDanhongtreatment after building up model, respectively. Renal pathological lesions, 24 h urine protein excretion and renal function were observed. The concentration of TGF-β1 in renal cortex and overall expression of TGF-β1 in renal tissue was examined by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, respectively. Results: Mild to moderate proliferation of glomeruli mesangial cells accompanied by broadened mesangium matrix, glomeruli capsule wall adhesion and change of capillary wall, interstitial fibrosis and inflammatory monocytes infiltration was found in the model group other than the control group. Renal lesions were alleviated dramatically in treated group, while compared to that in model group. The gross renal pathological score in model group was higher than that in control group (P<0.05), however, the score in treated group was lower than that in model group (P<0.05). The 24 h urinary protein excretion in model group and treated group was higher than that in control group (P<0.01), while the 24 h urinary protein excretion in treated group was lower than that in model group (P<0.01). There was no significant difference among the three groups regarding blood creatinine level and urea level. Serum CysC levels in model group and treated group increased significantly than that in control group (P<0.05). The concentration of TGF-β1 in renal cortex and overall expression of TGF-β1 in renal tissue were higher in model group than those in control group(P<0.05), while those in treated group were lower than those in model group (P<0.05). TGF-β1 expression level in renal tissues was significantly associated with both the urinary protein excretion and the total renal pathological scores (P<0.01). Conclusions:Danhongalleviated renal pathological lesions by down-regulating TGF-β1 expression.

Key WordsChronic kidney disease；Transforming growth factor β1；Danhong

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是一種緩慢進展性疾病。其發病率高，知曉率和治療率低。早期診斷和治療是決定CKD患者預后的關鍵因素。腎臟纖維化是各種CKD進展至終末期腎衰竭的共同表現，主要特征為細胞外基質(ECM)堆積、肌成纖維細胞增多以及腎小管炎性細胞浸潤[1]。TGF-β1在促進腎臟炎性反應和纖維化過程中發揮關鍵作用[2]。輕度腎功能損害患者的TGF-β1水平已高于正常人群[3]。丹紅能夠抑制TGF-β1的表達、改善組織纖維化，在不同CKD動物模型中能同時減輕腎組織損傷和下調局部TGF-β1表達[4-5]，但目前對其在早期腎臟損害中的作用尚不明確。本研究采用單側腎切除法建立CKD大鼠模型，探討丹紅對早期CKD的治療價值及與TGF-β1的關系，以期為早期CKD的治療提供更多的選擇，并為丹紅臨床干預CKD提供理論依據。

1資料與方法

1.1動物及模型建立健康清潔級雄性SD大鼠30只，6周齡，體質量160 g左右。30只SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為3組：模型組、對照組和干預組，分別予以單側腎切除法建立早期CKD動物模型[6]、假手術(切開皮膚分離皮下組織、肌肉，直至腎臟，但不作腎切除，再依次縫合各層組織)及建立早期CKD模型后給予丹紅干預。術后1周起， 模型組和對照組大鼠給予0.9%氯化鈉液[7 mL/(kg·d)]腹腔注射，干預組以等量丹紅注射液(山東菏澤步長制藥有限公司， 國藥準字：Z20026866，批號： 12081007，10 mL/支)腹腔注射。3組大鼠均于術后12周處死。

1.2大鼠腎臟病變情況處死大鼠后切除左腎，部分腎組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅染色(H-E)、過碘酸-無色品紅染色(PAS)、六胺銀染色(PASM)和Masson染色，由腎臟病理科醫師在光鏡下觀察 。參照文獻[7-8]分別對腎小球硬化、腎小球基底膜 (glomerular basement membrane, GBM)病變和腎間質纖維化程度進行分級，計算相應的病理積分。三者積分之和定義為腎組織病理總積分 。

1.324 h尿蛋白量和腎功能指標用代謝籠收集大鼠24 h尿液，應用美國強生公司Vitros 350全自動干式生化分析儀測定尿蛋白濃度并計算24 h尿蛋白量(mg/d)，即尿蛋白濃度(mg/mL)×24 h尿量(mL/d)。動物處死后自心臟采血，4000 r/min離心10 min獲取血清，應用美國羅氏公司P800全自動生化分析儀檢測血肌酐(Scr)、尿酸(UA)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin C, CysC)濃度。

1.4腎皮質TGF-β1濃度檢測處死大鼠后，取部分腎皮質組織，用4℃預冷的0.9%氯化鈉液漂洗，濾紙拭干、稱質量，加入 0.86%的0.9%氯化鈉液，用內切式組織勻漿器研磨制成組織勻漿。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法(試劑盒由江蘇南京建成生物工程研究所提供)檢測腎皮質勻漿中TGF-β1的表達情況。

1.5腎組織TGF-β1免疫組化檢測采用免疫組織化學方法檢測腎組織TGF-β1蛋白的表達情況，并做半定量分析。將石蠟切片于60℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，pH 8.0 EDTA微波抗原修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶；10%山羊血清室溫封閉30 min；滴加兔抗人TGF-β1抗體 (美國Santa Cruz 公司)，于4 ℃孵育過夜；滴加通用型羊抗兔二抗(MaxVision TM HRP-Polymer anti-Rabbit IHC Kit，福建福州邁新生物技術開發有限公司)，室溫孵育1 h后；用3,3-四鹽酸二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木精復染；光鏡下每張切片觀察10 個高倍視野(×200)。采用JEDA 801D 形態學圖像分析系統軟件(江蘇省捷達科技發展有限公司)分析視野內棕褐色陽性信號，計算TGF-β1 陽性表達率，即陽性信號占整個視野百分比的平均值。

2結果

2.1動物一般情況對照組、模型組和干預組大鼠各死亡1例，分別因不明原因麻醉過量、腹腔出血和麻醉后誤吸水分窒息所致。存活大鼠毛發整齊、有光澤，食欲佳，活動正常。各組大鼠飲食量與體質量無明顯差異。

2.2腎臟病理損傷情況與對照組相比，模型組腎小球輕中度系膜細胞增生伴局部系膜基質增寬、球囊壁粘連及毛細血管壁改變，腎小管間質有不同程度炎性細胞浸潤與間質纖維化；與模型組比較，干預組腎臟病變明顯減輕 。模型組的腎臟病理總積分高于對照組，干預組低于模型組；干預組腎小球硬化、腎小球基底膜病變和間質纖維化的單項積分均明顯低于模型組(表1)。

注： 與對照組比較，#P<0.05 ； 與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3各組24 h尿蛋白量與腎功能指標比較模型組與干預組24 h尿蛋白量高于對照組，干預組的24 h尿蛋白量低于模型組。3組動物血Scr、UA無明顯差異，但模型組和干預組血漿CysC濃度較對照組明顯增高。見表2。

注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4各組腎組織TGF-β1表達情況TGF-β1陽性表達于細胞質，經DAB 顯色 、蘇木素復染后呈棕黃色顆粒。3組大鼠腎小管上皮細胞、腎間質細胞和腎小球系膜細胞均見可見 TGF-β1棕黃色顆粒，其中以模型組表達最為顯著。模型組陽性表達率明顯高于對照組；干預組TGF-β1陽性表達率明顯低于模型組 (表 3)。

注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01 ；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.5腎臟TGF-β1表達量與尿蛋白量及病理損傷的相關性經過單因素相關分析，腎皮質TGF-β1濃度和腎組織TGF-β1陽性表達率均與24 h尿蛋白量、腎組織病理總積分顯著相關。見表4。

3討論

本研究中，干預組在單側腎切除后連續給予丹紅注射液腹腔注射，至研究終點時，與未行干預的模型組比較，干預組腎組織病理損傷改善，24 h尿蛋白量明顯減少。國內尚缺乏丹紅注射液干預CKD的報道，但對其有效組分的研究較多，顯示紅花黃素可減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎間質的纖維化程度[9-10]，而丹參及其有效成分丹參酮能減輕大鼠梗阻性腎病腎小管病變和阿霉素腎病腎小球硬化等[11]。本研究首次對早期CKD動物模型進行丹紅干預治療，證實其能顯著緩解甚至逆轉腎臟病理損傷、降低尿蛋白量。但是，臨床早期CKD患者是否能夠從丹紅治療中獲益，獲益程度與劑量、療程、遺傳學背景關系如何等，尚有待明確。

1997年，Wu等[7]采用腎臟次全切除建立CKD大鼠模型，通過原位雜交證實，TGF-β1在病變腎臟的硬化腎小球、腎間質和浸潤的單核細胞中呈高表達。Wang等[12]的研究中，切除5/6腎5周后的大鼠腎內TGF-β1呈高表達，腎小管間質明顯損傷。本研究采用改良的單側腎切除方法[6]建立了早期CKD大鼠模型，與對照組比較，模型大鼠表現出不同程度的腎小球系膜細胞、系膜基質、毛細血管壁及腎小管間質的損害，腎臟病理總積分明顯增加；血清CysC濃度和24 h尿蛋白量升高，但SCr水平無明顯變化。本研究中，免疫組化檢測顯示，TGF-β1在3組大鼠腎小管上皮細胞、腎間質細胞及腎小球系膜細胞均表達，其中以模型組表達最為顯著，模型組TGF-β1陽性表達率明顯高于對照組，提示在CKD早期，腎內TGF-β1已過度表達。TGF-β1可能通過以下機制促進腎臟損傷的病理進展：(1)激活Smad2、Smad3信號通路[13]，誘導 Smad3 依賴的細胞凋亡途徑[14]和β1 整合素的表達，促進腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞，分泌大量細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)[13]；(2)抑制ECM 降解酶活性，增強腎小管細胞表面纖維蛋白溶解酶原激活物抑制劑-1的活性抑制 ECM 降解[15]；(3)促進腎小球系膜細胞血管內皮生長因子[16]和α-平滑肌肌動蛋白[9]的表達；(4)增強基質金屬蛋白酶活性，導致蛋白水解，使腎小球基底膜增厚[17]。

本研究中，ELISA和免疫組化檢測結果顯示，干預組腎皮質TGF-β1表達較模型組減少，陽性表達率較模型組降低，提示丹紅連續干預治療能降低早期CKD大鼠腎組織中TGF-β1的表達。這與既往對丹參、紅花的研究[10]結果一致，且是對二者聯合作用的探討。本研究單因素相關分析顯示，腎皮質TGF-β1濃度及腎組織總TGF-β1陽性表達率均與 24 h尿蛋白量和腎組織病理總積分顯著相關。TGF-β1表達水平越高，腎臟病理損傷越嚴重，尿蛋白量越多，提示TGF-β1過表達是早期CKD動物腎臟損傷的重要因素。而丹紅能夠抑制TGF-β1 的表達，進而保護腎組織，減少尿蛋白。

綜上所述，單側腎切除的早期CKD大鼠模型腎臟病理損傷較重，腎內TGF-β1高表達；腹腔注射丹紅注射液后，腎臟病理損傷緩解，尿蛋白量減少，TGF-β1表達下調，提示丹紅可能通過下調TGF-β1的表達改善早期CKD腎臟病理改變。

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通訊作者鮑曉榮，E-mail：yqingmay@163.com

基金項目：上海市衛生和計劃生育委員會面上項目(編號：2011-295；2012-254)