細胞內Zn內流減少在低氧保護髓核細胞中的作用及其機制

殷瀟凡　徐俊　谷輝杰　吳旭華　劉建興　陳炯　宗陽銘

(上海市閔行區中心醫院，上海　201199)

·論著·

細胞內Zn內流減少在低氧保護髓核細胞中的作用及其機制

殷瀟凡徐俊谷輝杰吳旭華劉建興陳炯宗陽銘

(上海市閔行區中心醫院，上海201199)

摘要目的：探討細胞內Zn2+的濃度在低氧調節髓核細胞表達金屬蛋白酶(metalloproteinases, MMPs)和細胞外基質(ECM)中的作用及其機制。方法： 從SD大鼠中提取髓核細胞后首先進行平面培養，然后用藻酸鈉凝膠進行三維培養。采用FluoZin-3 AM染色法檢測細胞內Zn2+的濃度(intracellular Zn2+concentration， [Zn2+]i)；采用阿利新藍染色分析細胞分泌蛋白多糖的含量，采用二甲基亞甲藍分光光度法(DMMB)檢測糖胺聚糖的表達水平，采用real-time PCR分析II型膠原(α1 type II collagen，COL2A1)、金屬蛋白酶13 (matrix metalloproteinase 13，MMP-13)和解整合素樣金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motif 5，ADAMTS-5)mRNA的表達。通過免疫組化法和Western印跡法分析鋅鐵轉運蛋白8(ZRT,IRT-like protein 8,ZIP8)的表達水平。結果： IL-1β和ZnCl2可以顯著提高髓核細胞內的[Zn2+]i，但是該作用可以被低氧所抑制。在藻酸鈉三維培養的髓核細胞中，低氧可以顯著改善IL-1β和ZnCl2引起的蛋白多糖、糖胺聚糖和COL2A1 mRNA的降低，但ZnCl2可以抑制低氧的保護作用。細胞內Zn2+的螯合劑和低氧可以抑制MMP-13 mRNA水平的升高。IL-1β和ZnCl2促進髓核細胞中ZIP8的表達升高，但是低氧可抑制ZIP8的表達。結論： 低氧可以調節髓核細胞中Zn2+的內流，Zn2+介導了低氧對髓核細胞中MMP-13和ECM的調節作用。[Zn2+]i的變化可能參與了椎間盤退變的過程。

關鍵詞鋅；低氧；髓核細胞；代謝

中圖分類號R681.5

文獻標識碼A

Effect and Mechanism of Decreasing Intracellular Zn2+Influx in the Hypoxia Protection of Nucleus Pulposus CellsYINXiaofanXUJunGUHuijieWUXuhuaLIUJianxingCHENJiongZONGYangming

CentralHospitalofMinghangDistrict,Shanghai201199,China

AbstractObjective： To explore the effect and mechanism of intracellular Zn2+concentration ([Zn2+]i) in hypoxia-induced regulation of metalloproteinases (MMPs) and extracellular matrix (ECM) expression in nucleus pulposus (NP) cells. Methods： NP cells from SD rats received plate culture at first and then three-dimensional culture with sodium alginate gel. [Zn2+]i was assayed by FluoZin-3 AM staining. Proteoglycan was assayed by Alcian blue staining. Glycosaminoglycan was detected by 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB) assay. And real-time PCR were used to assay the mRNA expression of α1 type II collagen (COL2A1), matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) and a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motif 5 (ADAMTS-5). The expression of ZRT,IRT-like protein 8(ZIP8) was assayed by immunohistochemistry and Western blotting. Results： Interleukin (IL)-1β and ZnCl2could significantly increase the [Zn2+]i of NP cells, however, the effect could be inhibited by hypoxia. Hypoxia did significantly attenuate the decrease of proteoglycan, glycosaminoglycan, and COL2A1 mRNA, which was induced by IL-1β and ZnCl2treatment, in sodium alginate three-dimensional culture. However, ZnCl2inhibited the protective effect of hypoxia. Both an intracellular Zn2+chelator and hypoxia could inhibit the increase of MMP-13 mRNA expression. IL-1β and ZnCl2treatment promoted the increase of ZIP8 expression in NP cells, however, hypoxia inhibited ZIP8 expression. Conclusions： Hypoxia may regulate the Zn2+influx in NP cells. Zn2+mediates the regulation effect of hypoxia on ECM and MMP-13. Perhaps the changes of [Zn2+]i are involved in the process of intervertebral disc degeneration.

Key WordsZinc;Hypoxia;Nucleus pulposus cells;Metabolism

有關椎間盤退變的發生發展機制，目前尚不明確[1-2]。許多潛在致病因素均可引起椎間盤中代謝平衡失調，導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解。椎間盤中主要的ECM包括Ⅱ型膠原和蛋白多糖，而金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和解整合素樣金屬蛋白酶(disintegrins and metalloproteinases with thrombospondin motifs，ADAMTSs)是降解ECM的主要蛋白酶[3]。MMP-1、 MMP-2、 MMP-3、 MMP-7、 MMP-8、 MMP-10和MMP-13以及ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5在退變椎間盤中的表達水平高于正常椎間盤。在本研究中，我們主要分析MMP-13和ADAMTS-5。

哺乳動物的MMPs包含1個保守結構，這個結構包括自我抑制的前結構域和1個催化結構域[4]。其中，催化結構域包含1個催化的Zn2+、1個結構性的Zn2+和3個典型的Ca2+；前結構域包含1個保守的半胱氨酸的開關結構[5]。當MMPs失活的時候，Zn2+的活性區域會被結合從而抑制半胱氨酸的活性；當MMPs激活的時候，Zn2+與半胱氨酸的交互作用則被打亂[5]。因此，Zn2+在MMPs介導的基質降解過程中十分重要。近來發現，Zn2+與骨關節炎患者中MMPs介導的細胞外基質的降解過程密切相關[6]。然而，對于Zn2+在椎間盤細胞代謝中的作用，目前尚知之甚少。

低氧是椎間盤代謝的重要特點。由于椎間盤缺乏血液供應，椎間盤髓核中氧分壓僅0.5 kPa，髓核細胞處于乏氧的狀態。但是，低氧對髓核細胞有一定的保護作用，低氧可以提高髓核細胞中蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達水平。有研究[7]發現，低氧可以減少胰腺β細胞中Zn2+的內流。但是，在髓核細胞中低氧與Zn2+的關系尚不明確，本文旨在對此作一探討。

1資料與方法

1.1實驗試劑與耗材3周大小250 g左右的SD大鼠購自復旦大學動物科學部。鈣離子熒光探針FluoZin-3 AM購買自美國Invitrogen生命技術公司，ZIP8一抗購自美國Proteintech公司，白細胞介素-1β(IL-1β)、Pluronic F-127、鋅離子螯合劑TPEN[N,N,N′,N′-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine]、DMB(1,9-dimethylmethylene blue),硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)和阿利新藍染液購自美國Sigma公司。所有有關細胞培養的試劑均購自美國 Gibco 公司。

1.2實驗方法

1.2.1髓核細胞的培養參考已經發表的文獻[8]，在顯微鏡下將膠凍樣的髓核組織從大鼠的腰椎間盤中取出并在0.1%的Ⅱ型膠原酶中消化4 h，然后經70 μm的濾器過濾。用高糖的含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基培養髓核細胞。平面培養兩代后，將髓核細胞消化后進行三維培養。

1.2.2藻酸鈉三維培養為了避免髓核細胞的去分化，將髓核細胞培養在藻酸鈉凝膠中。將1×106/mL的細胞重懸在1.2%的低黏度的藻酸鈉氯化鈉溶液中(藻酸鈉溶于150 mmol/L的氯化鈉溶液中)。用22G的注射器將上述細胞懸液逐滴滴加在200 mmol/L的CaCl2溶液中。30 min后，藻酸鈉發生聚化，形成球形的小珠子，然后用150 mmol/L的氯化鈉溶液和DMEM清洗，清洗后在24孔板中培養。

當需要將髓核細胞從凝膠中釋放出來進行實驗時，將凝膠在2.2%的枸櫞酸鈉溶液中37℃孵育10 min，然后用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化5 min并離心，即可得到細胞團。

1.2.3實驗設計為了達到低氧狀態,將水凝膠中的髓核細胞培養在三氣培養箱,充氮氣以維持1%O2的低氧狀態。用100 μmol/L ZnCl2和(或)10 ng/mL IL-1β處理髓核細胞24 h。用TPEN螯合游離的Zn2+時，在加ZnCl2和IL-1β前2 h加入TPEN。

1.2.4細胞內Zn2+水平的測量采用FluoZin-3 AM染色法測定細胞內的鋅離子濃度(intracellular Zn2+concentration， [Zn2+]i)。在玻璃培養皿上培養的髓核細胞加2 μmol/L FluoZin-3和0.1% Pluronic F-127后，在37℃中孵育37 min，進行Zn2+的加載。然后用D-Hanks清洗細胞后再孵育20 min。使用倒置的共聚焦顯微鏡在激發波長為490 nm和發射波長為530 mm的條件下觀察髓核細胞中的熒光強度。為了進行半定量分析，將髓核細胞培養在24孔板中，經上述處理后用多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司；型號：Flex Station3)采集各組的熒光強度。

1.2.5組織學檢測藻酸鈉水凝膠珠子用4%的多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋后切成4 μm厚的切片。將阿利新藍8GX溶解在冰醋酸中，配成1%溶液。室溫下用此溶液孵育凝膠切片30 min。用 0.1%的核固紅反染20 s后進行梯度脫水。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍后在光學顯微鏡下觀察。同時，對切片進行HE (hematoxylin-eosin)染色和甲苯胺藍染色。

1.2.6免疫組化和細胞免疫熒光采用免疫組化法或者免疫熒光法觀察大鼠的椎間盤、平面培養的細胞和三維培養的髓核細胞中ZIP-8的表達水平。取大鼠尾椎Co6～7，在10%甲醛中固定2 d，然后在10%乙二胺四乙酸 (ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)中脫鈣1個月。將椎間盤切片后與藻酸鈉凝膠切片一同進行脫蠟和脫水，用3%雙氧水孵育20 min，在檸檬酸鈉緩沖液中加熱進行抗原修復。用含0.1%Triton X-100的5%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h后，將細胞及切片加ZIP8一抗(1∶200)后4℃孵育過夜。最后，切片加辣根過氧化物酶標記的二抗后常溫下孵育2 h，并用蘇木素反染；而細胞則加入由異硫氰酸熒光素(FITC)標記的二抗后暗室中孵育2 h，并用二脒基苯基吲哚(DAPI)染核。細胞和切片在分別使用倒置熒光顯微鏡和正置顯微鏡進行觀察(日本Olympus公司)。

1.2.7糖胺聚糖產量的檢測采用二甲基亞甲藍分光光度法(DMMB法) 分析培養基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan， GAG)的產量。實驗設計中的處理完成后，收集培養基并使用離心濾器(美國Millipore公司；型號：Centricon YM-50)以5300 r/min速度離心30 min。

1.2.8Western印跡提取細胞的總蛋白時，將含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液加入到三維培養后從藻酸鈉凝膠中提取的髓核細胞中，采用二喹啉甲酸(BCA)法分析總蛋白的濃度。配置好SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)膠后，將總蛋白上樣，上樣量為50 mg。電泳后，濕轉至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜。用5%的脫脂奶粉封閉2 h，然后加ZIP8和β-actin (1∶1000)的一抗4℃孵育過夜。用TBST(Tris-buffered saline with Tween)洗膜3次后，用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在常溫下孵育2 h，清洗后用增強化學發光曝光儀(美國PerkinElmer公司)進行觀察。采用AlphaEaseFC 4.0 software對條帶進行半定量分析。

1.2.9Real-time PCR采用TRIzol法提取總RNA并測量濃度，用逆轉錄試劑盒(立陶宛 MBI Fermantas 公司)將1 μg RNA逆轉錄為cDNA。應用Mastercycler○Rep realplex(德國Eppendorf公司)熒光定量PCR儀進行PCR，PCR引物如表1所示。20 μL的PCR反應混合物包括2 μL的2倍稀釋的cDNA, 10 μL SYBR PremixEx Taq Ⅱ, 0.2 μL引物，用去離子水補足。反應程序為50℃ 2 min；95℃ 30 s； 95℃ 5 s， 40個循環； 60℃ 34 s。獲取Ct(cycle threshold)后，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因進行校正。mRNA的相對水平采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.3統計學處理采用Graphpad Prism5 和SPSS 19 軟件進行統計學分析。多組之間參數的比較采用方差分析；如果有統計學意義，采用Tukey’s test進行兩兩之間的比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1低氧降低髓核細胞中Zn2+的濃度在20%的常氧環境下，ZnCl2和IL-1β 可顯著提高髓核細胞中的[Zn2+]i(P<0.05)，見圖 1A、 1B。采用同樣的ZnCl2和IL-1β處理條件，在1%低氧環境下髓核細胞中的[Zn2+]i明顯小于常氧環境時(P<0.05)，提示低氧可以抑制髓核細胞中的Zn2+水平。在低氧環境中，ZnCl2和IL-1β協同作用下髓核細胞中的[Zn2+]i明顯大于ZnCl2和IL-1β單獨作用時的水平。

A：熒光顯微鏡下髓核細胞中的[Zn2+]i；B：A圖的半定量分析,*P<0.05,**P<0.01

圖1髓核細胞中的[Zn2+]i

2.2[Zn2+]i的變化參與低氧引起的三維培養髓核細胞中ECM的改變如圖2A～D所示，培養在直徑為2～4 mm的珠子狀的凝膠中，髓核細胞仍然維持著類軟骨的特性(圖2E～H)。阿利新藍染色結果顯示，與常氧相比較，低氧可以提高髓核細胞中蛋白多糖的產量(圖2I)。更重要的是， 低氧條件下ZnCl2處理后的髓核細胞中的蛋白多糖明顯多于常氧條件下同樣處理的髓核細胞，提示低氧可以緩解ZnCl2引起的ECM的降解。

采用DMMB和real-time PCR分析糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型膠原(α1 type Ⅱ collagen，COL2A1) mRNA的變化。相對常氧環境，低氧能顯著提高經ZnCl2和IL-1β處理后的髓核細胞中的GAG和COL2A1 mRNA的表達(圖2J、 2K,P<0.05)。低氧可以提高經IL-1β處理的髓核細胞中的GAG和COL2A1 mRNA的表達，但這種作用可以被ZnCl2所抑制，這提示ZnCl2引起的Zn2+內流甚至可以逆轉低氧對髓核細胞的保護作用。

A～H：髓核細胞的藻酸鈉三維培養；I：髓核細胞的阿利新藍染色；J：髓核細胞中糖胺聚糖產量的檢測；K：髓核細胞中COL2A1的mRNA的表達；*P<0.05,**P<0.01

圖2三維培養的髓核細胞的大體圖片、阿利新藍染色、DMMB分析以及COL2A1 mRNA的表達

2.3[Zn2+]i的變化參與低氧引起的三維培養髓核細胞中MMPs的改變由于MMPs和ADAMTSs是降解髓核ECM的主要蛋白酶，因此，我們也分析了[Zn2+]i對它們的作用。相對于常氧，低氧抑制了IL-1β引起的MMP-13和ADAMTS-5 mRNA水平的升高， 但該作用會被IL-1β 和ZnCl2協同作用逆轉(圖3A,P<0.05)。TPEN是一種膜通透性的Zn2+的螯合劑。與低氧的作用相似，TPEN也可以顯著抑制ZnCl2引起的髓核細胞中MMP-13 mRNA表達的升高(圖3B，P<0.05)。然而，較為奇怪的是，Zn2+內流的單獨作用并不能調節ADAMTS-5的表達。

2.4ZIP8的表達及在低氧和IL-1β作用下的變化由于ZIP8介導了軟骨細胞中Zn2+的內流，因此，我們就其在髓核細胞中的表達水平進行了研究。免疫組化和免疫熒光顯示，在髓核組織和培養的髓核細胞中，細胞膜和細胞漿中均有ZIP8表達(圖4A～F)。ZnCl2提高了藻酸鈉凝膠中的髓核細胞中ZIP8的表達(圖4G)。IL-1β使髓核細胞中ZIP8表達增加，且有劑量依賴作用(圖4G)。不論IL-1β處理與否，低氧均可抑制ZIP8的表達，體現了ZIP8在低氧抑制[Zn2+]i中的作用(4H、I)。

A～F：髓核組織中、平面培養以及三維培養的髓核細胞中ZIP8的表達；G：IL-1β作用下髓核細胞中ZIP8的表達；H：IL-1β以及低氧下髓核細胞中ZIP8的表達；I：H中相對量的分析。*P<0.05,**P<0.01

圖4ZIP8在髓核組織和髓核細胞中的表達以及低氧和IL-1β對ZIP8表達的影響

3討論

與機體中的其他細胞不同，髓核細胞更傾向于生活在低氧的環境中；在低氧環境中髓核細胞的活性和ECM的代謝平衡更加穩定[9]。雖然通常認為缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)和缺氧誘導因子2α(hypoxia-inducible factor 2α，HIF-2α)介導了低氧的作用，但仍有研究者持不同見解[10]；而且有關HIF對ECM的確切作用目前仍然未知，可能有其他的介質介導了低氧的作用。本研究證明，細胞內Zn2+的水平變化可能是低氧調節ECM的重要因素。

在正常生理狀況下，Zn2+的平衡與骨骼生長、胚胎發育以及神經和免疫系統密切相關[11-12]。在骨關節中，Zn2+與軟骨細胞的凋亡和ECM的重塑相關[6, 13]。在髓核細胞中，我們發現Zn2+的內流可以引起MMPs的升高和ECM的降解，這提示細胞內Zn2+的變化可能參與椎間盤的退變。我們還發現，ZnCl2和 IL-1β可引起[Zn2+]i 和ZIP8表達的升高。由于IL-1β是公認的引起椎間盤分解代謝的因子，因此，Zn2+的內流可能介導了IL-1β對椎間盤的作用，而ZIP8可能介導了IL-1β引起的Zn2+的內流。

細胞內游離的Zn2+主要由多種Zn2+轉運體進行調節，其中ZIP14 (SLC39A14) 和ZIP13 (SLC39A13)調節生長板中細胞Zn2+的內流，而ZIP8則參與軟骨細胞中Zn2+的內流[11, 14]。本研究發現，低氧可以抑制ZIP8的表達。因此，我們推測低氧可能通過抑制ZIP8蛋白的表達來抑制Zn2+的內流，有待后續研究進一步證實。

由于Zn2+是MMPs的重要組成成分，故細胞內Zn2+水平的改變可以調節MMP-13和ECM，這也符合邏輯。但是，我們發現，ZnCl2單獨處理髓核細胞并不足以引起細胞中ADAMTS-5表達的增加，這與之前報道的結果相一致[6]。然而，ZnCl2和IL-1β的協同作用可以引起ADAMTS-5的改變，這說明Zn2+對ADAMTS-5的作用小于對MMP-13的作用。

在平面培養的條件下，髓核細胞容易出現去分化的現象，伴隨著Ⅱ型膠原和蛋白多糖等細胞表型的表達降低；而用藻酸鈉凝膠進行的三維培養可以顯著抑制髓核細胞的去分化[15]。

綜上所述，低氧抑制髓核細胞中Zn2+的內流，這可能介導了MMP合成的減少和ECM的降解。Zn2+轉運體ZIP8也由低氧進行調節，因此，ZIP8可能介導了低氧狀態Zn2+內流的抑制。這些結果說明，細胞內Zn2+水平的變化可能是將來防治椎間盤退變的一個潛在的靶點。

參考文獻

[1]Sakai D, Grad S. Advancing the cellular and molecular therapy for intervertebral disc disease[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:159-171.

[2]Fontana G, See E, Pandit A. Current trends in biologics delivery to restore intervertebral disc anabolism[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:146-158.

[3]Vo NV, Hartman RA, Yurube T, et al. Expression and regulation of metalloproteinases and their inhibitors in intervertebral disc aging and degeneration[J]. Spine J, 2013,13(3): 331-341.

[4]Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metallo-proteinases and the regulation of tissue remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8(3): 221-233.

[5]Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry[J]. Circ Res, 2003,92(8): 827-839.

[6]Kim JH, Jeon J, Shin M, et al. Regulation of the catabolic cascade in osteoarthritis by the zinc-ZIP8-MTF1 axis[J]. Cell, 2014,156(4): 730-743.

[7]Gerber PA, Bellomo EA, Hodson DJ, et al. Hypoxia lowers SLC30A8/ZnT8 expression and free cytosolic Zn2+in pancreatic beta cells[J]. Diabetologia, 2014,57(8): 1635-1644.

[8]江立波, 張小磊, 徐華梓, 等. 細胞自噬對饑餓環境下椎間盤髓核細胞的保護作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012,28(7): 1302.

[9]Chen JW, Li B, Yang YH, et al. Significance of hypoxia in the physiological function of intervertebral disc cells[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2014,24(3): 193-204.

[10]Gogate SS, Nasser R, Shapiro IM, et al. Hypoxic regulation of beta-1,3-glucuronyltransferase 1 expression in nucleus pulposus cells of the rat intervertebral disc: role of hypoxia-inducible factor proteins[J]. Arthritis Rheum, 2011,63(7): 1950-1960.

[11]Fukada T, Hojyo S, Furuichi T. Zinc signal: a new player in osteobiology[J]. J Bone Miner Metab, 2013,31(2): 129-135.

[12]Fukada T, Yamasaki S, Nishida K, et al. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling[J]. J Biol Inorg Chem, 2011,16(7): 1123-1134.

[13]Sauer GR, Smith DM, Cahalane M, et al. Intracellular zinc fluxes associated with apoptosis in growth plate chondrocytes[J]. J Cell Biochem, 2003,88(5): 954-969.

[14]Hojyo S, Fukada T, Shimoda S, et al. The zinc transporter SLC39A14/ZIP14 controls G-protein coupled receptor-mediated signaling required for systemic growth[J]. PLoS One, 2011,6(3): e18059.

[15]Rastogi A, Thakore P, Leung A, et al. Environmental regulation of notochordal gene expression in nucleus pulposus cells[J]. J Cell Physiol, 2009,220(3): 698-705.

通訊作者宗陽銘，E-mail：18918169029@189.cn