載脂蛋白A-I模擬物的功能

劉源 張崧 葉平?

載脂蛋白A-I模擬物的功能

劉源 張崧 葉平?

近年，載脂蛋白A-I模擬物療法這一相對較新的領域取得許多重要進展，支持其不僅有治療心血管疾病的強大潛力，同時涉及慢性炎癥和氧化以及其他疾病狀態的治療。正在開發中的各種載脂蛋白A-I模擬肽均顯示出強有力的心臟保護功能，可媲美甚至超越全長載脂蛋白A-I（apoA-I）和高密度脂蛋白（HDL），本文旨在探討這些肽分別負責哪些不同的功能，同時確定其結構特征和運行機制。

1 膽固醇流出功能

迄今為止，HDL最主要被研究的功能是促進膽固醇逆向轉運（RCT）的能力。探討載脂蛋白A-I模擬肽促進RCT的研究主要是針對單螺旋肽和雙螺旋肽，其中的一些肽在促進CE的過程中表現出可以與全長apoA-I相似甚至超越的能力。如雙螺旋模擬肽5A在脂質貧乏時可以通過介導ABCA1促進膽固醇流出，而非ABCG1，而且5A與合成的磷脂棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿（POPC）聯合應用會增加3倍的膽固醇流出，這一過程主要是通過增強非特異性水溶液擴散的作用。在易發生動脈粥樣硬化的apoE基因缺陷小鼠靜脈給予5A/POPC，循環高密度脂蛋白通過增加ABCA1和ABCG1的水平使得磷脂和膽固醇流出增加［1］。該研究還通過追蹤放射性膽固醇從巨噬細胞到糞便的運動，發現5A/POPC輸液增加了全身的RCT。另有研究關注一種被稱為ETC-642的多肽/脂質復合物，它是由單螺旋肽ESP 24218，鞘磷脂，和1，2 -二棕櫚酰-sn-甘油基-3 -磷酸膽堿（DPPC）以質量比1：3.75：3.75合成的。ETC-642對膽固醇流出人類巨噬細胞這一過程表現出劑量依賴性的影響，這與脂化全長載脂蛋白A-I（apoA-I/ POPC）的效果相似。

為明確雙螺旋肽對高密度脂蛋白功能的影響，其各種結構特征已被探測。許多的特征對膽固醇流出的效率和特異性有顯著的影響，包括疏水性，疏水面的大小，電荷和多肽連接橋的靈活性等，最終確定-0.5的平均疏水性值是最理想的，而增加疏水面的尺寸、維持電中性和橋的靈活性都對膽固醇流出有益。利用這一研究結果，一個“理想的”肽ELK-2A2K2E被設計出來，它被證明有很高的促進膽固醇流出的能力，明顯比全長載脂蛋白A-I更有效。

除了提高合成肽在一個特定的功能，如膽固醇流出中的作用更有效，研究者還努力增加它們的生物穩定性和可用性。載脂蛋白A-I模擬肽的螺旋結構被一種稱為烴縫合的技術而穩定化合成，即在兩圈螺旋結構之間引入共價鍵。這種連接是針對螺旋的特殊位點，防止其解旋，穩定其對抗高溫和蛋白酶變性。此修改不僅可以增加一個給定肽的膽固醇流出能力，也代表可以減少腸道蛋白水解的潛在手段，從而增加口服肽的生物利用度。應用于幾個現有模擬肽的另一種方法是以D型的氨基酸合成的，而不是天然存在的L型異構體。這種合成方式能讓其抵御腸道蛋白水解酶的作用，同時保留了生物物理特性以及大多數生物功效［2］。

2 抗炎功能

如前所述，高密度脂蛋白可以通過各種機制抑制炎癥過程，目前模擬肽被證明能復制這些活動，如ETC-642。在體外，ETC-642處理人頸動脈內皮細胞（HCAECs）可以降低由TNF-α刺激的THP-1單核細胞的粘附和減少VCAM-1、MCP-1和NK-κB的mRNA表達。在體內，研究者利用新西蘭白兔制成一個增加ICAM-1和VCAM-1表達的血管炎癥模型，以前的研究表明，載脂蛋白A-I和HDL都可以在這個模型中降低細胞粘附分子的表達［3］，而靜脈注射30mg/kg ETC-642同樣可以逆轉兩個粘附分子的增加。

研究表明，單螺旋肽4F可以影響發展為疾病狀態的炎癥心血管疾病所導致的炎癥。在一個小規模的臨床研究中，感染了艾滋病病毒并接受抗逆轉錄病毒聯合療法的患者被發現有較高的HDL炎癥指數（HII），表明這些患者的HDL在調節炎癥方面的缺陷。然而，隨著4F治療這些患者的HDL的抗炎活性恢復［4］。在大鼠慢性腎臟疾病（CKD）模型中，4F的皮下給藥減少血管脂質沉積和由5/6腎切除術導致的炎癥。這些報道支持載脂蛋白A-I模擬肽具有廣泛的抗炎功能，推動進一步研究其用于治療非心血管疾病相關的炎癥性疾病的潛在用途。

載脂蛋白A-I模擬肽可以影響抗炎活性的結構特征也被探究。雙螺旋肽兩個螺旋之間的不對稱性被認為是其抑制單核細胞表達CD11b最重要的因素，例如將對稱的肽ELK的第二螺旋改變，使得它不再與第一螺旋相同，該肽抑制CD11b表達的能力會有所增加。此外，維持中性或陰性的凈電荷以及＜180°的疏水面也對抗炎能力有好處。也有研究發現，可以影響抗炎癥反應的結構特征在不同細胞類型中發揮的作用是不同的，與CD11b在巨噬細胞表達相比，VCAM-1在內皮細胞的表達受多肽螺旋不對稱性的影響很輕微，而增加疏水性表面的大小以及凈正電荷的肽被發現是有利的。這一觀察結果顯示了人工精心設計的模擬肽在對炎癥的選擇性干預方面有巨大的潛力。

3 抗氧化功能

氧化的低密度脂蛋白（oxLDLs）是血管壁發生炎癥和動脈粥樣硬化的一個強效的觸發器。載脂蛋白A-I模擬物與健康人的高密度脂蛋白和載脂蛋白A-I一樣可以通過多種機制抑制或阻止低密度脂蛋白脂質和蛋白質的氧化修飾，包括（1）作為活性氧和氧化脂質的直接清除劑。（2）抑制氧化啟動物質如12 -脂氧合酶的作用。（3）抑制與高密度脂蛋白活動相關的酶如PON1和PAF-AH的活性。前文關于載脂蛋白A-I模擬肽的抗炎特性所討論的大鼠慢性腎病模型，對載脂蛋白A-I模擬物的抗氧化功能也進行了觀察。在此模型中，腎功能減退導致系統性氧化應激的增加，用4F處理后主動脈壁中蛋白質的氧化產物（硝基酪氨酸）的數量會降低，血漿和尿中的脂質氧化產物（丙二醛）的濃度也降低。4F還通過影響抗氧化酶減少氧化應激。錳超氧化物歧化酶（MnSOD）是一種催化超氧負離子生成水和過氧化氫的抗氧化劑酶，在卵巢癌細胞株，4F治療增加MnSOD的表達水平和活性［5］。

對于影響載脂蛋白A-I模擬肽抗氧化能力的結構特征，研究證實包含半胱氨酸或組氨酸的雙螺旋模擬肽ELK和5A會增加其抑制LDL脂質氧化的能力。其他一些結構變化如利用一個丙氨酸殘基取代脯氨酸從而改變肽連接鍵的靈活性，或轉換到G型或Y型螺旋都會增加其抗氧化的能力。

4 新興領域

炎癥和氧化是除了心血管疾病之外許多疾病的共同特點，因此，載脂蛋白A-I模擬肽的抗炎和抗氧化作用可能在其他與炎癥和氧化應激相關的疾病狀態也很有用。目前的研究主要包括以下幾個方面。

4.1 抗腫瘤功能 已有研究表明載脂蛋白A-I及其模擬肽對小鼠卵巢癌模型中抑制腫瘤的發展能產生有利影響，其中首先發現的是，當被注入了上皮性卵巢腺癌細胞系（ID8細胞）后，載脂蛋白A-I轉基因小鼠比野生型小鼠的生存時間更長，抑制了腫瘤發展。隨后對載脂蛋白A-I模擬肽的研究發現，在體外，用4F和5F處理ID8細胞導致細胞活力和增殖減少，在體內，皮下注射4F能降低腫瘤質量和體積，這種效果可能是由于載脂蛋白A-I模擬物治療的動物增加了溶血磷脂酸（LPA），一種已知可促進腫瘤發生的溶血磷脂，與高密度脂蛋白結合的結果［6］。如前所述4F能誘導卵巢癌細胞抗氧化酶MnSOD表達和活性升高，也有助于4F發揮抗腫瘤效果。5F肽可以通過另外的機制，如抑制血管生成，以防止腫瘤的發展。

4.2 抗哮喘功能 哮喘是一種慢性疾病，特點是氣喘、咳嗽、呼吸急促，是由于肺部氣道的過度炎癥反應所致。因為載脂蛋白A-I模擬肽已知的抗炎的特性，研究人員推測，其可以作為一種治療哮喘的有效方法。利用5A肽治療由塵螨誘發的小鼠哮喘模型可以阻礙哮喘相關的特征，包括氣道高反應性及氣道重塑的發展［7］。5A治療還減少了支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數量，可能是減少了細胞因子和趨化因子表達的結果。

4.3 對膿毒癥的作用 由脂多糖（LPS）誘導的大鼠膿毒癥模型會導致低血壓，主要是通過激活核因子-κB信號后增加了一氧化氮生成酶NOS2表達的結果。在此模型注射4F后會促進LPS被HDL有效的中和，改善血管的收縮［8］。HDL螯合LPS的能力既往已知，但4F肽似乎可以明顯增強這種效果。表面等離子體共振技術已經證明，4F對促炎氧化脂類的結合力比載脂蛋白A-I高4～6個數量級，這很可能是該肽能發揮強效抗炎特性的一個主要因素。

4.4 對SLE的作用 4F肽也可以在自身免疫疾病系統性紅斑狼瘡（SLE）中發揮作用。在系統性紅斑狼瘡與加速動脈粥樣硬化的小鼠模型中，4F能減少自身抗體產生，減輕骨質稀少和腎小球腎炎等與SLE導致的癥狀［9］。這些有益的效果很大程度上是由于apoA-I/HDL/模擬肽公認的保護機制，包括抑制VCAM-1和隔離氧化磷脂。應用4F治療后的模型小鼠主動脈損傷面積增加，但會增加更多的平滑肌區域，降低巨噬細胞區域，形成一個更穩定的組分分布。

5 對心血管疾病的影響

上述的各項研究表明，高密度脂蛋白許多的心臟保護作用，可以被顯著的特異性使用模擬肽所概括。此外，載脂蛋白A-I模擬肽治療至今還未出現較大的毒性問題。因此，許多研究人員現在已經開始在動脈粥樣硬化的各種動物模型和臨床研究中，將模擬肽這些能力與心血管結果及心血管健康的直接測量指標相關聯。在高脂血癥家兔模型，注射ETC-642后使用血管內超聲（IVUS）評估，發現其可以減輕主動脈斑塊負擔，這種效應可能與減少促炎性帶負電荷的LDL的治療相關。對載脂蛋白E基因敲除小鼠的模擬肽注射5A磷脂復合物后，主動脈斑塊面積減少達53%，機制可能是增加了膽固醇流出。

4F肽也已被證明對糖尿病小鼠具有抗動脈粥樣硬化的能力。ApoE基因敲除小鼠給予鏈脲佐菌素誘發高血糖后，與不給予鏈脲佐菌素的apoE基因敲除小鼠相比，增加了＞3倍的動脈粥樣硬化病變面積。但是，這種動脈粥樣硬化面積的增加可以在4F治療后減少近50%［10］。4F還被證明可以增加胰島素敏感性，并防止糖尿病心肌病的發生。

為比較載脂蛋白A-I模擬物口服和皮下注射這兩種給藥方式的療效是否有區別，接受西方飲食的apoE基因敲除小鼠被利用而研究。通過不同方式使用的相同劑量4F都會降低血漿中急性期蛋白血清淀粉樣蛋白A（SAA）的水平，改善HDL炎癥指數，并抑制大約50%的主動脈粥樣硬化。雖然皮下給藥會使4F血漿水平增加很明顯，但通過任意一種方法使用4F對于心血管壓力的測量數值的效果相似。這些數據表明，模擬肽的效力是由給定的劑量所決定的，而非給藥方式或血漿濃度。此外，兩種給藥方式在糞便中肽的量是相同的，可能預示4F肽在胃腸道中起重要作用。

1 Amar MJ, D’Souza W,Turner S, etal. 5A apolipoprotein mimetic peptide promotes cholesterol efflux and reduces atherosclerosis in mice. J Pharmacol Exp Ther, 2010, 334(2):634～641.

2 Navab M, Anantharamaiah G M, Hama S, et al. Oral administration of an Apo AI mimetic peptide synthesized from D-amino acids dramatically reduces atherosclerosis in mice independent of plasma cholesterol.Circulation, 2002, 105(3): 290～292.

3 Nicholls SJ, Dusting GJ, Cutri B, et al. Reconstituted high-density lipoproteins inhibit the acute pro-oxidant and proinflammatory vascular changes induced by a periarterial collar in normocholesterolemic rabbits. Circulation, 2005,111:1543～1550.

4 Kelesidis T, Yang OO, Currier JS, et al. HIV-1 infected patients with suppressed plasma viremia on treatment have pro-inflammatory HDL. Lipids Health Dis, 2011, 10:35.

5 Ganapathy E, Su F, Meriwether D, et al. D-4F, an apoA-I mimetic peptide, inhibits proliferation and tumorigenicity of epithelial ovarian cancer cells by upregulating the antioxidant enzyme MnSOD. Int J Cancer, 2012, 130:1071～1081.

6 Su F, Kozak KR, Imaizumi S, et al. Apolipoprotein A-I (apoA-I) and apoA-I&mimetic peptides inhibit tumor development in a mouse model of ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107:19997～20002.

7 Yao X, Dai C, Fredriksson K, et al. 5A, an apolipoprotein A-I mimetic peptide,attenuates the induction of house dust mite-induced asthma. J Immunol, 2011,186:576～583.

8 Dai L, Datta G, Zhang Z, et al. The apolipoprotein A-I mimetic peptide 4F prevents defects in vascular function in endotoxemic rats. J Lipid Res, 2010, 51:2695～2705.

9 Woo JM, Lin Z, Navab M, et al. Treatment with apolipoprotein A-1 mimetic peptide reduces lupus-like manifestations in a murine lupus model of accelerated atherosclerosis. Arthritis Res Ther, 2010, 12:R93.

10 Morgantini C, Imaizumi S, Grijalva V, et al. Apolipoprotein A-I mimetic peptides prevent atherosclerosis development and reduce plaque inflammation in a murine model of diabetes. Diabetes, 2010, 59:3223～3228.

國家973項目（2013CB530804）

100039 北京解放軍總醫院心血管內科 （劉源 葉平）天津醫科大學總醫院保健醫療部 （張崧）

*通訊作者