不同液體容量復蘇對大鼠內毒素性急性肺損傷的防治作用及機制探討

陳娜，王樹影，裴凌

(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001)

急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭，病死率為30% ～40%，嚴重威脅患者的生命［1］。引起 ALI的原因有多種，其中內毒素是導致ALI的重要致病因子［2］。研究［3］表明，在失血性休克和感染引起的ALI動物模型中，羥乙基淀粉能減輕肺組織的炎癥反應。高滲氯化鈉羥乙基淀粉40注射液是一種高滲晶膠混合液，在補充血容量方面能發揮很好作用。本研究觀察了不同液體容量復蘇對大鼠內毒素性ALI的防治作用，并探討其可能機制，旨在為臨床ALI患者液體的選擇提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠50只，體質量250～300 g，6～8周齡。采用隨機數字表法將50只大鼠分為A、B、C、D、E組各10只。

1.2 主要試劑及儀器 內毒素(Sigma公司，美國);氯化鈉溶液(華仁藥業有限公司);6%羥乙基淀粉130/0.4溶液(Fresenius Kabi公司，德國);高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液(上海華源長富藥業有限公司);TNF-α試劑盒(Cloud-clone公司，美國);肺表面活性蛋白-D(SP-D)試劑盒(Cloud-clone公司，美國);DFC450光鏡(200×，Leica公司，德國)。

1.3 內毒素性ALI模型制備及液體容量復蘇 A、B、C、D組大鼠麻醉采用腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg。常規備皮消毒后做氣管切開，保留自主呼吸，行面罩吸氧，氧濃度為60%，流量2 L/min。游離一側股動、靜脈，分別行穿刺置管術，靜脈用于給藥和補液，動脈用于采血及通過換能器與多功能監測儀相連監測平均動脈壓(MAP);參照文獻［4］介紹的方法制備內毒素性ALI模型，5 mg/kg內毒素溶于0.5 mL生理鹽水中經股靜脈緩慢注射1 min。E組給予等量生理鹽水。以氧合指數≤300 mmHg時為模型制備成功［5］，后開始液體容量復蘇，并將此時作為零時，分別經股靜脈注入高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液(A組)、氯化鈉溶液(B組)、6%羥乙基淀粉130/0.4溶液(C組)，以15 mL/kg恒速輸注6 h;D組不注入任何液體，E組注入等量生理鹽水。

1.4 觀察方法 記錄注射內毒素前及液體復蘇1、3、6 h各組MAP變化。于液體復蘇6 h時采集股動脈血0.3 mL進行血氣分析，記錄PaO2、乳酸(Lac)水平，計算氧合指數。于上述時點另取血1.2 mL，4℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清，－80℃保存。采用ELISA方法測定TNF-α、SP-D，操作按試劑盒說明書進行。容量復蘇6 h后處死大鼠，即刻開胸，結扎左主支氣管，取下左肺，用蒸餾水沖洗肺表面血液，濾紙吸干表面水分，用電子分析天平稱肺濕重(W)，后置于80℃恒溫烤箱48 h，取出稱干重(D)，計算濕/干重(W/D)值。在大鼠左肺取出后，即刻行右肺內灌注和內固定，取下右肺上葉，放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片(4 μm)、脫蠟、蘇木素伊紅(HE)染色、封片后在DFC450光鏡下觀察肺組織病理形態變化。按照Mikawa等［6］的方法從四項指標進行肺損傷評分:①肺泡充血;②出血;③間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集;④肺泡間隔增厚或透明膜形成;根據每項指標病變輕重進行0～4分半定量分析(0:無或極輕微損傷;1:輕度損傷;2:中度損傷;3:重度損傷;4:極重度損傷)，累加各項評分的總分作為ALI的病理評分。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時點MAP水平比較 結果見表1。

表1 各組大鼠不同時點MAP水平比較(mmHg，±s)

表1 各組大鼠不同時點MAP水平比較(mmHg，±s)

注:與E組比較，*P＜0.05;與 D組比較，#P＜0.05;與 B組比較，ΔP ＜0.05。

組別MAP注射內毒素前 液體復蘇1 h 液體復蘇3 h 液體復蘇6 h A組 105±5 88±3*#Δ 82±2*#Δ 79±4*#Δ B組 102±6 76±4*# 65±4*# 56±3*#C組 103±8 88±5*#Δ 80±3*#Δ 79±4*#Δ D組 101±7 65±6* 54±5* 42±7*E組103±3 103±5 101±5 100±4

2.2 各組大鼠W/D值、肺損傷評分、PaO2、氧合指數及TNF-α、SP-D、Lac水平比較 結果見表2。

2.3 各組大鼠肺組織病理形態學變化 E組肺組織結構完整，肺泡腔中無滲出液或滲出的中性粒細胞;D組雙肺明顯水腫，肺泡結構完整性遭到嚴重破壞，彌漫性中性粒細胞滲出、聚集;B組肺組織破壞嚴重，大量中性粒細胞浸潤，肺泡腔內可見滲出液;C組和A組肺組織結構基本完整，出血和中性粒細胞浸潤情況較B組明顯減輕。

表2 各組大鼠W/D值、肺損傷評分、PaO2、氧合指數及TNF-α、SP-D、Lac水平比較(±s)

表2 各組大鼠W/D值、肺損傷評分、PaO2、氧合指數及TNF-α、SP-D、Lac水平比較(±s)

注:與 E 組比較，*P ＜0.05;與 D 組比較，#P ＜0.05;與 B 組比較，ΔP ＜0.05;與 C 組比較，☆P ＜0.05。

組別 W/D值 肺損傷評分(分) PaO2(mmHg) 氧合指數(mmHg)TNF-α(pg/mL) SP-D(ng/mL) Lac(mmol/L)A 組 4.54 ±0.14*#Δ 3.7 ±1.5*#Δ 129 ±16*#Δ 215 ±27*#Δ 32.4 ±1.2*#Δ 31.6 ±2.3*#Δ 2.52 ±0.19*#Δ☆B 組 5.08 ±0.09*# 10.1 ±2.3*# 92 ± 6*# 154 ± 9*# 52.6 ±3.1*# 47.3 ±1.7*# 3.90 ±0.21*#C 組 4.56 ±0.13*#Δ 4.9 ±1.5*#Δ 132 ±16*#Δ 219 ±27*#Δ 34.1 ±1.3*#Δ 32.2 ±2.6*#Δ 3.29 ±0.23*#Δ D 組 5.97 ±0.16* 11.3 ±1.2* 73 ± 4* 122 ± 8* 64.2 ±2.4* 69.5 ±3.6* 4.72 ±0.25*E 組 4.08 ±0.08 0.5 ±0.5 207 ± 6 346 ±10 24.0 ±0.7 13.9 ±1.1 1.65 ±0.21

3 討論

ALI/ARDS可由直接肺損傷(如肺炎、胃內容物的吸入和有毒物質的吸入)和間接肺損傷(如膿毒血癥、創傷性休克、輸血和急性胰腺炎)引起，其中最常見的原因是細菌或病毒性肺炎［7］。ALI/ARDS患者的病死率極高，需要積極治療。目前認為，液體治療是肺損傷治療的第一步，也是最基本的治療方案。相對于晶體，膠體能有效提高血漿膠體滲透壓，維持血容量。在ALI早期，機體處于低心排血量和低灌注狀態，采用積極地液體復蘇策略可以補充血容量，增加心排血量，改善組織灌注。

ALI/ARDS患者由于彌漫性肺微血管內皮細胞損傷常導致肺組織水腫，從而表現為頑固性低氧血癥和血流動力學不穩定狀態。本研究顯示，E組大鼠各時點MAP平穩，PaO2、氧合指數正常;D組大鼠在給予內毒素后隨著時間延長MAP、PaO2和氧合指數進行性下降;而A、B、C組大鼠MAP、PaO2和氧合指數盡管也有下降，但與D組比較，下降程度得到改善，尤其是A、C組。A、B、C組W/D值明顯低于D組，尤其是A、C組。上述結果說明，上述三種液體(尤其是后兩種)均可以逆轉內毒素引起的MAP、PaO2和氧合指數下降，減輕肺組織水腫，改善大鼠組織氧供，使大鼠血流動力學更加穩定，從而有可能減少其他并發癥的發生。

SP-D主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞合成并分泌至肺泡表面，有助于維持肺組織表面活性物質水平的穩定，參與免疫防御和下調炎癥反應，因此其在ALI/ARDS的發生發展中發揮著重要作用［8，9］。動物實驗表明，內毒素導致的ALI模型，在SP-D缺乏型小鼠和SP-D正常型小鼠的對比研究中，SP-D通過抑制粒細胞巨噬細胞刺激因子途徑，抑制外周單核/巨噬細胞向肺內遷移，從而抑制炎癥反應［10］。Liu等［11，12］將人類 SP-D 重組體作用于變應原攻擊后的小鼠，發現SP-D能抑制TNF-α的產生，其機制可能是SP-D作用于CD14/toll樣受體，阻斷病原體的刺激而發揮抗炎作用。在內毒素誘導的ALI動物模型中，將含有SP-D的肺表面活性物質注入氣管后，電鏡觀察到肺泡巨噬細胞的溶酶體結構內含有SP-D與內毒素的聚集體，結果表明SP-D能減輕內毒素的損傷，阻止肺損傷的發生和發展［13］。ALI/ARDS發生后，肺毛細血管膜完整性遭到破壞，通透性增加，導致肺泡表面的SP-D向血管內滲漏，使肺內 SP-D 水平明顯減少［14］。研究［15］顯示，油酸注入肺泡后4 h(病理證實有呼吸道、肺泡損傷及肺水腫，但可以認為無肺泡Ⅱ型上皮細胞增生)測得血清SP-D水平明顯升高。由此SP-D可以作為肺泡上皮細胞損傷、肺毛細血管通透性改變的生物學標記物之一，因此監測血清SP-D變化有利于指導治療、改善ALI/ARDS患者的預后。TNF-α是單核細胞產生的一種重要的炎性因子，機體在創傷、燒傷和大手術等打擊后，體內免疫細胞處于被激活狀態，首先肺巨噬細胞被激活，釋放大量的前炎癥細胞因子，如IL-1和TNF-α，這兩種多功能的因子作用于中性粒細胞(PMN)和其他細胞。當PMN被激活時，能產生和釋放活性氧，通過氧化細胞膜脂質直接損傷肺泡上皮細胞和內皮細胞，同時PMN還可合成并釋放TNF-α、IL-1等多種炎性因子，導致肺組織損害加重。

本研究顯示，氯化鈉溶液、6%羥乙基淀粉130/0.4溶液和高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液均能降低內毒素性ALI大鼠血清SP-D水平，且與肺組織病理變化和血清TNF-α水平變化相一致，而兩種膠體液的容量復蘇效果更加顯著，其機制可能是它們能有效維持肺內SP-D水平，調節SP-D炎癥抑制作用。雖然C組和A組肺損傷程度無顯著性差異，但A組Lac水平低于C組，而對Lac水平的連續監測可以評價ALI/ARDS的嚴重程度和判斷預后狀況，因此高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液更適合內毒素性ALI的早期容量復蘇。

［1］Leng YX，Yang SG，Song YH，et al.Ulinastatin for acute lung injury and acute respiratory distress syndrome:a systematic review and meta-analysis［J］.World J Crit Care Med，2014，3(1):34-41.

［2］Wang HM，Bodenstein M，Markstaller K.Overveiw of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury［J］.Eur Surg Res，2008，40(4):305-316.

［3］Balkamou X，Xanthes TI，Streumpoulis K，et al.Hydroxyethyl starch 6(130/0.4)ameliorates acute lung injury in swine hemorrhagle shock［J］.Anesthesiology，2010，113(5):1092-1098.

［4］Xie J，Lv R，Yu L，et al.Hydroxyethyl starch 130/0.4 exerts its anti-inflammatory effect in endotoxemic rats by inhibiting the TLR4/NF-κB signaling pathway［J］.Ann Clin Lab Sci，2010，40(3):240-246.

［5］俞敏，田兆方.急性肺損傷標志物的研究進展［J］.中國當代兒科雜志，2014，16(1):94-98.

［6］Mikawa K，Nishina K，Takao Y，et al.ONO-1714，anitric oxide synthase inhibitor，attenuates endotoxin-induced acute lung in rabbits［J］.Anestth Analg，2003，97(6):1751-1755.

［7］Ware LB，Matthay MA.The acute respiratory distress syndrome［J］.N Engl J Med，2000，342(18):1334-1349.

［8］Ikegami M，Grant S，Korfhagen T，et al.Surfactant protein-D regulates the postnatal maturation of pulmonary surfactant lipid pool sizes［J］.J Appl Physiol，2009，106(5):1545-1552.

［9］Gaunsbaek MQ，Rasmussen KJ，Beers MF，et al.Lung surfactant protein D(SP-D)response and regulation during acute and chronic lung injury［J］.Lung，2013，191(3):295-303.

［10］King BA，Kingma PS.Surfactant protein D deficiency increases lung injury during endotoxemia［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，44(5):709-715.

［11］Liu CF，Chen YL，Shieh CC，et al.Therapeutic effect of surfactant protein D in allergic inflammation of mite-sensitized mice［J］.Clin Exp Allergy，2005，35(4):515-521.

［12］Liu CF，Chen YL，Chang WT，et al.Mite allergen induces nitric oxide production in alveolar macrophage cell lines via CD14/tolllike receptor 4，and is inhibited by surfactant protein D［J］.Clin Exp，2005，35(12):1615-1624.

［13］Walther FJ，Gupta M，Mbagwu N，et al.Paradoxical effects of exogenous protein on lung function in surfactant-deficient rats endotoxin［J］.Exp Lung Res，2000，26(4):273-285.

［14］Jobe A，Ikegami M，Jacobs H，et al.Permeability of premature lamb lungs to protein and the effect of surfactant on that permeability［J］.Appl Physiol，1983，55(1 Pt 1):169-176.

［15］Pan T，Nielsen LD，Allen MJ，et al.Serum SP-D is a marker of lung injury in rats［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，282(4):824-832.