紅芪總多糖對衰老大鼠體內(nèi)自由基清除及抗氧化能力的調(diào)節(jié)作用

雷豐豐，岳淑琴，孫禮剛，張常青，桑迎竹

(1甘肅省人民醫(yī)院，蘭州730000;2寧夏醫(yī)科大學(xué))

研究表明，衰老是由于自由基對細(xì)胞成分的進(jìn)攻造成的結(jié)果，維持體內(nèi)適當(dāng)水平的抗氧化劑和自由基清除劑水平，可以延長壽命和推遲衰老。紅芪總多糖(THPS)是從紅芪中分離得到的總多糖，含有氨基酸、有機酸、B-谷甾醇紅芪多糖、微量元素等多種生物活性物質(zhì)［1，2］，其性溫味甘，具有補氣固表、利尿解毒、排膿、斂瘡生肌等作用，能增強和調(diào)節(jié)免疫功能［3～8］。2013年6～9月，我們觀察了 THPS對衰老大鼠體內(nèi)自由基清除及抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 Wistar大鼠72只，體質(zhì)量200～230 g，雌雄各半，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。置于清潔級動物室中，對大鼠進(jìn)行稱重、編號，隨機分為 A、B、C、D、E、F 組各12只。

1.2 THPS、試劑與儀器 THPS:為本研究所提取，甘肅武都產(chǎn)紅芪，由蘭州大學(xué)藥學(xué)院封士蘭教授鑒定，經(jīng)水提、醇析、酶解及Sevag法除蛋白，紫外分光光度計280 nm檢測無蛋白吸收峰為止，具體方法參照文獻(xiàn)［9］。D-半乳糖;硫代巴比妥酸(TBA)。超氧陰離子)、超氧化物歧化酶(SOD)、羥自由基(OH－·)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)試劑盒;其他均為國產(chǎn)分析純試劑。752紫外可見分光光度計;TGL-40B離心機;DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴箱;Imo-1型電動勻漿器;BL3100型(精確度0.1 g);BP221S 型(精確度0.1 mg)電子天平;超聲波清洗器;旋渦混勻器。

1.3 衰老模型制備及THPS干預(yù) D-半乳糖用生理鹽水配成濃度為5%的注射液，A、B、C、D、E組大鼠腹部皮下注射D-半乳糖500 mg/(kg·d)制備衰老模型［10］，F(xiàn)組大鼠腹部注射相同劑量的生理鹽水，連續(xù)注射56 d。造模后第2天，A、B、C、D 組分別給予 50、100、200、400 mg/kg THPS，E、F 組給予10 mL/kg生理鹽水，自由進(jìn)食水，連續(xù)30 d。最后一次給藥5 h后，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，暴露腹部，下腔靜脈取血，離心后取上清液作為待測血清。分離肝組織制成組織勻漿，離心后取上清液作為待測肝臟組織勻漿。

1.5 大鼠體內(nèi)OH－·檢測 采用Fenton反應(yīng)體系。反應(yīng)體系含0.15 mmol/L、pH 7.4 的 PBS 1.0 mL，40 μg/mL 番紅花紅 T 1.0 mL，3%H2O21.0 mL，0.954 mmol/L EDTA-Fe2+1.0 mL，再加入1.0 mL 不同質(zhì)量濃度的供試液，混勻后于37℃保溫30 min，然后于520 nm波長處測定A值。空白組以蒸餾水代替供試液，對照組以蒸餾水代替供試液和EDTA-Fe2+，同時設(shè)立試劑空白管，計算清除率，清除率=(A樣品－A空白)/(A對照－A空白)×100%。

1.6 大鼠血清、肝組織SOD活性檢測 采用黃嘌呤氧化酶法。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算抑制率，根據(jù)抑制率和標(biāo)準(zhǔn)品的活性建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。SOD活性的測定按照試劑說明書進(jìn)行。SOD活性=(試劑對照管吸光度－測定管吸光度)÷試劑對照管吸光度÷50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

1.7 大鼠血清、肝組織GSH-PX活性檢測 利用GSH-PX可催化過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成水及氧化型谷胱甘肽的作用，因此GSH-PX活性可用其酶促反應(yīng)的速度來表示。通過測定該酶促反應(yīng)的還原型谷胱苷肽的消耗量就可求算酶活性。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。設(shè)立非酶管(試劑對照管)一支、酶管(測試管)的數(shù)目等于待測樣本數(shù)目;按照試劑說明書進(jìn)行血清及肝臟GSH活性的測定。GSH活性=(非酶管OD值－酶管OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.8 大鼠血清、肝組織MDA含量檢測 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm波長處有最大吸收峰，從而根據(jù)吸光度的不同測定出待測樣品中的MDA含量，即TBA法。設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管和測定空白管各1支，按照試劑說明書進(jìn)行血清MDA的測定。MDA含量(nmol/mL)=(測定管吸光度－測定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×10 nmol/mL×樣品測試前的稀釋倍數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 連續(xù)給予D-半乳糖6周后，E組大鼠行動遲緩，進(jìn)食減少，毛色灰暗亂無光澤，形體瘦弱，體質(zhì)量增加較慢，活動明顯減少，抓取時可感覺到活動力相對較弱，易于抓取，反應(yīng)遲鈍，呈現(xiàn)明顯的衰老體征。A、B、C、D組大鼠的食量、活動、毛色、體質(zhì)量和反應(yīng)能力明顯好轉(zhuǎn);相比A、B、C組，D組大鼠毛發(fā)柔順有光澤、反應(yīng)靈敏、體質(zhì)量增加較快、更喜歡活動。

表1 各組大鼠體內(nèi)、OH－ ·清除率比較(±s)

表1 各組大鼠體內(nèi)、OH－ ·清除率比較(±s)

注:與 E 組比較，*P ＜0.05。

組別 n O－·2清除率 OH－·清除率A 組 12 9.23%* 5.33%*B 組 12 10.67%* 17.21%*C 組 12 16.35%* 22.54%*D 組 12 21.83%* 26.64%*E組 12 － －F組12 － －

2.3 各組大鼠血清及肝臟MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性比較 結(jié)果見表2。

3 討論

自由基是人體正常的代謝產(chǎn)物，其來源于兩方面，一是外源性自由基，二是內(nèi)源性自由基，生理情況下機體通過線粒體呼吸鏈內(nèi)氧化磷酸化途徑、Ca2+依賴性的磷脂酶A2所激發(fā)的花生四烯酸代謝途徑、黃嘌呤—黃嘌呤氧化酶途徑、精氨酸-NO合成酶途徑產(chǎn)生自由基。正常情況下人體內(nèi)的自由基是處于不斷產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中。人體內(nèi)存在少量的自由基不但對人體不構(gòu)成威脅，而且還可以促進(jìn)細(xì)胞殺滅細(xì)菌、消除炎癥、分解毒物。但如果自由基的數(shù)量過多，就會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過氧化，干擾人體的正常代謝活動，加速人體衰老進(jìn)程［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的 THPS對、OH－·均有清除作用，并且呈明顯的量效關(guān)系，D組作用最強，說明大劑量的THPS對自由基抵御能力最強。文獻(xiàn)［12～14］報道，自由基是衰老的決定性因素。結(jié)合上述報道，本實驗間接提示THPS可能有抗衰老作用，THPS濃度越高，抗衰老作用越強。

表2 各組大鼠血清及肝組織MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性比較(±s)

表2 各組大鼠血清及肝組織MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性比較(±s)

注:與 E 組比較，*P ＜0.05。

組別MDA含量(nmol/mL)血清 肝組織SOD活性(U/mL)血清 肝組織GSH-PX活性(U/mL)血清 肝組織A 組 68.44 ±16.3 249.4 ±20.2 55.32 ±13.43 125.34 ±12.46 69.35 ±11.47 130.66 ±12.45 B 組 62.44 ±13.7* 233.6 ±18.7 60.11 ±14.27 129.44 ±14.33 75.22 ±13.04* 145.65 ±12.66 C 組 53.36 ±10.2* 204.6 ±17.3* 67.44 ±12.56* 135.49 ±11.57* 79.56 ±15.75* 155.45 ±16.02*D 組 50.33 ±12.6* 195.5 ±21.4* 69.33 ±13.62* 138.52 ±12.52* 83.55 ±13.43* 164.44 ±15.22*E 組 76.23 ±12.5 266.5 ±18.5 50.43 ±12.55 117.23 ±14.54 65.44 ±14.33 124.45 ±13.34 F 組 48.32 ±13.3 181.6 ±12.3 75.36 ±12.66 143.36 ±12.29 90.35 ±13.08 171.67 ±14.38

在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)氧化—抗氧化系統(tǒng)保持著動態(tài)平衡，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)受到氧化損傷或氧化應(yīng)激刺激這種平衡被打破后就會對機體造成損害，引發(fā)各種疾病和衰老。細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最主要的氧化損傷，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，氧化損傷引起MDA生成量的增加，而MDA又可進(jìn)一步激發(fā)細(xì)胞多方面的損傷。生物體內(nèi)的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)主要包括SOD、過氧化氫酶、CSH-PX等?？寡趸赶到y(tǒng)是機體內(nèi)源性的自由基清除劑，SOD和GSH-PX均是重要的抗氧化酶，他們在清除自由基、預(yù)防延緩衰老方面有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，THPS可提高大鼠血清和肝組織SOD、GHS-Px均有升高作用，同時也能降低模型動物血清和肝組織自由基代謝的主要產(chǎn)物MDA的作用，并且以上作用具有劑量依賴性，由此推測THPS具有抗氧化作用，其不但能減輕脂質(zhì)過氧化物對組織或細(xì)胞的損傷，而且還能增加機體對自由基損傷的防御機能，THPS劑量越大，抗氧化能力越強。

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