脂氧合酶在血管新生中的作用

胡夏云邢怡橋（審校）

脂氧合酶在血管新生中的作用

胡夏云1邢怡橋2（審校）

脂氧合酶；血管新生

血管的形成和發生是一基本的的生物學過程，在機體正常的生長發育和創傷修復過程中都具有重要意義[1]，同時對許多疾病的發生也具有重要影響，比如慢性炎癥，腫瘤的生長、轉移[2-3]以及非腫瘤性的血管源性疾病，如動脈粥樣硬化[4-5]、早產兒視網膜病變、糖尿病視網膜病變等許多眼病[6-7]均有新生血管形成，這些疾病嚴重威脅人類的健康，尋找參與血管新生的相關因素成為治療這類新生血管性疾病的關鍵。研究顯示，動物體內脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在細胞生長存活、增殖分化、衰老凋亡、新陳代謝和免疫調節[8]等方面發揮不同的作用。本文介紹LOX在血管新生方面的生物作用及其可能作用機制。

1 LOX概述

LOX是以鐵離子為輔基的一組同工酶，具有雙加氧酶和氫過氧化物酶的雙重活性，專一催化具有順、順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸加氧反應，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物。多不飽和脂肪酸，主要是花生四烯酸（arachidonic acid，AA），定位于膜磷脂作為細胞膜的結構成分，在一些條件刺激下釋放AA，然后通過環氧合酶、LOX及細胞色素P-450三條途徑被代謝。根據底物加氧位點的不同，LOX主要可分為5-、8-、12-、15-LOX四種[9]。比如5-LOX在鈣的刺激下由細胞質轉移到核膜上，5-LOX激活蛋白與細胞膜磷脂中釋放出來的AA特異性結合，將后者呈遞給5-LOX并將其激活，5-LOX催化AA，在第5位碳原子處形成羥基，生成5-羥基二十碳四烯酸（5-HETE）和白三烯B4；8-LOX則在AA的第8位碳原子處加入羥基形成8-HETE；12-LOX則催化生成12-HETE，并且還可以產生15-HETE；15-LOX-1可作用于AA和亞油酸分別生成15/12-HETE和 13-羥基十八碳二烯酸（13-SHODE），而15-LOX-2專門催化AA為15-HETE。

5-LOX主要存在于白細胞，在B淋巴細胞和肺動脈內皮細胞中也有發現[10]；12-LOX主要存在于血小板，也存在于其它細胞中，如平滑肌細胞、角質細胞、內皮細胞和腫瘤細胞；12-LOX有3種同工酶，分別是血小板型、白細胞型及表皮型[11]，其中血小板型廣泛存在于人體；哺乳動物細胞內的15-LOX又可分為15-LOX-1及15-LOX-2兩個亞型。15-LOX-1主要分布于網狀細胞，未成熟紅細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、氣管支氣管上皮細胞和皮膚中也有分布[12]，而15-LOX-2分布有限，主要在前列腺、肺部、皮膚和角膜中被檢測到其mRNA。

2 LOX在新生血管形成中的促進作用

2.1 血管新生概述 血管新生是指在原來存在的血管結構上長出新血管的復雜的生物學過程，是細胞－細胞、細胞－基質及細胞－細胞因子相互作用的結果。外周血液循環中的血管內皮細胞充滿著血管形成促進因子（比如VEGF）、血管形成抑制因子、蛋白水解酶（如MMPS）、細胞表面分子（如整合素）等[13]，正常的情況下上述各因子處于非增殖的靜止狀態，當某種刺激因素打破這種平衡，就會導致局部新生血管的產生。新生血管形成起始的中心環節是血管內皮細胞的增殖、遷移、分化及管腔形成，其過程大致可以分為五個階段，第一階段：母本血管內皮滲透性的增加；第二階段：母本血管基底膜和細胞外基質崩解；第三階段：穿過基底膜和細胞外基質（ECM）的內皮芽形成；第四階段：內皮細胞移行和分裂增殖；第五階段：內皮細胞分支和管腔形成。而AA代謝LOX產物影響內皮細胞很多功能，包括內皮細胞屏障的維持，白細胞與內皮細胞的黏附作用，內皮細胞移行、增殖、生存以及產生生物活性介質[14]。

2.2 LOX增加血管內皮細胞的通透性 血管通透性的增加使循環中的血漿蛋白進入ECM中形成一種暫時性基質，允許并支持內皮細胞和成纖維細胞內向移動，遷移的成纖維內皮細胞合成并分泌基質蛋白、蛋白聚糖、內皮細胞從而形成新的血管。VEGF又稱血管通透因子，通過增加小血管內皮細胞的囊泡、細胞器、囊狀結構的活性來促進內皮細胞周圍血漿成分的改變，以及通過鈣黏蛋白/鏈蛋白復合體使單層內皮細胞之間的黏附連接松解，從而提高小血管的通透性，這是其它生長因子所沒有的特性。LOX催化產生的AA代謝產物被證明可以上調VEGF的表達從而增加血管通透性最終促進新生血管形成。實驗[15]發現12-LOX引起的病理性血管新生主要在于它增加了VEGF的表達。Nie D等[16]證明12-LOX的抑制劑可減少人前列腺癌PC-3細胞中VEGF的表達；而過度表達12-LOX的PC-3細胞其VEGF蛋白的水平是對照組的3倍，證明12-LOX在VEGF表達的調節中發揮重要作用。同樣有研究[17]發現，抑制12-LOX表達可以減弱人臍靜脈血管內皮細胞（HUVESC）中VEGF引起的血管形成，而加入12（s）-HETE后則可恢復VEGF引起的血管新生作用。Romano等[10，18]發現，在人類惡性間皮瘤中，5-LOX的代謝產物5-HETE可促進VEGF轉錄，證明5-LOX及其產物通過提高VEGF的表達來促進新生血管的形成。

當然VEGF的作用不僅僅表現在提高血管通透性，同時具有促進內皮細胞增殖、遷移和血管形成，改變細胞外基質，上調細胞間黏附分子-1的基因表達等作用，參與血管新生形成的多個過程。

2.3 LOX引起血管基底膜和細胞外基質崩解 基底膜和ECM的崩解與多種蛋白酶的作用有關，其中基質金屬蛋白酶（MMPS）構成了ECM降解的最重要的蛋白水解系統，在正常成年組織中僅低水平表達，而在血管或組織重構過程中其活性明顯上調。Ye等[19]發現暴露于香煙中的小鼠引起的炎癥性腺瘤中5-LOX的表達增加，同時伴隨著MMP-2和VEGF表達的上調，抑制5-LOX則降低結腸腺瘤的形成和減少血管新生，及這些動物結腸中MMP-2和VEGF蛋白的表達。通過對HUVESC的研究，發現吸煙明顯增加細胞增殖及5-LOX、VEGF、MMP-2和MMP-9的表達，而抑制5-LOX則可削弱上述作用[20]。5-LOX抑制劑則可以下調MMP-9在血管性疾病和癌癥中的表達[21-22]。Liu等[23]在雞胚絨毛尿囊膜（CAM）和HUVESC實驗中得出LOX抑制劑以劑量依賴的方式顯著抑制了bFGF引起的CAM血管新生，HUVECs的增殖及內皮細胞的移行和分化為分枝網管狀結構，而這些抑制作用是通過減少MMP-2及其活性實現的。因此上述實驗均表明LOX有可能是通過上調MMPS的表達從而引起血管基底膜和ECM的崩解參與新生血管的形成過程。

2.4 LOX引起內皮細胞移行、增殖及管腔的形成微脈管內皮細胞的移行、增殖和管腔形成在血管新生中發揮重要作用，研究發現，5（S）-HETE，12（S）-HETE和15（S）-HETE都參與微脈管內皮細胞的形成和遷移。Van等[24]研究顯示，缺氧引起15-LOX-1及其催化產物15（S）-HETE和12（S）-HETE在視網膜微脈管內皮細胞（HRMVEC）中的表達從而引起HRMVEC遷移，管道形成和基底膜矩陣血管生成，而LOX抑制劑可抑制缺氧引起的上述作用。此外，他們發現只有15（S）-HETE顯著引起了HRMVEC的遷移，其趨化作用比20ng/mL FGF-2還要高，但5（S）-HETE、12（S）-HETE和15（S）-HETE對HRMVEC的管腔形成都有作用。Hsieh等[25]實驗顯示三者都能引起內皮細胞的增殖、黏附和移行，并且可以部分逆轉抑制劑齊留通對內皮細胞增殖和移行的抑制作用。

內皮細胞的增殖、遷移和出芽是通過細胞-細胞外間質的黏附作用侵入血管周圍間質，又通過細胞-細胞的黏附作用促進血管條索的形成。整合素是介導細胞與細胞外間質黏附作用的主要因子，而且還介導細胞的生長發育、增殖分化及細胞凋亡。在體內外實驗中證明α1β1、αvβ3、αvβ5整合素均影響血管形成，其表達于血管內皮細胞的有腔面和無腔面，介導內皮細胞的遷移和毛細血管官腔的形成。另外堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是迄今發現的促進內皮細胞增殖作用最強的生長因子，研究發現，LOX可影響整合素和bFGF的表達。

Tang等[26]實驗證明12-HETE通過加強后轉錄和蛋白激酶C依賴的方式，加強大鼠肺動脈內皮細胞和小鼠肺微血管內皮細胞αvβ3的表達，12-HETE作用1h引起αvβ3mRNA的表達，約4h到達高峰，持續16h，從而參與血管新生的過程中。Pidgeon等[27]實驗顯示，在前列腺癌中轉染了血小板型12-LOX的PC3細胞和a431細胞或是經12-HETE處理的野生型PC3細胞和a431細胞，其αvβ3、αvβ5的表達均增加，12-LOX抑制劑則可減少αvβ5介導的細胞黏附和存活。Pidgeon等[28]研究表明，鼠Walker癌肉瘤細胞中過度表達血小板型12-LOX可上調αvβ5的合成。Zeng等[29]實驗證明在人微脈管內皮細胞中5（S）-HETE引起bFGF-2的表達從而促進人微脈管內皮細胞的DNA合成，而抗bFGF-2抗體則可完全阻斷5（S）-HETE引起的血管新生作用。Nie等[30]指出12-LOX抑制劑可抑制由VEGF或bFGF刺激引起的內皮增殖、遷移，而且這種作用可以通過添加12（S）-HETE而被部分消弱。

因此，LOX可能通過影響整合素和bFGF等細胞生長因子的表達從而參與內皮細胞遷移出芽、增殖及管腔形成，從而促進血管新生。

3 LOX在新生血管中的抑制作用

LOX家族分類多樣，代謝產物復雜，從而發揮多樣甚至是相反的生物學作用。LOX不僅具有促進血管新生的作用，對抑制血管生成也可能發揮作用，目前研究顯示具有抑制作用的是15-LOX-1[31]。Viita等[32]研究顯示，15-LOX-1在兔子骨骼肌中通過減少VEGF-A和PIGF蛋白翻譯從而顯著減弱了血管異常性病變，包括血管通透性、血管擴張、毛細血管灌注和血管數量的增加。其機制可能：①NO可以直接刺激內皮細胞增殖、移行、管腔形成以及血管重建和保持血管的完整性。VEGF-A引起內皮NO合酶蛋白的表達和增強其活性，而VEGF-A的這種作用可被15-LOX-1抑制；②VEGF-A和PIGF引起血管新生的作用是通過激活VEGFR2實現，而過氧化物酶體增值激活受體（PPAR-）調節VEGFR2和其他促進血管新生信號分子的表達，在轉染了生長因子的兔子肌肉中內源性PPAR-和VEGFR2都顯著增加，然而這種增加可以被15-LOX-1有效抑制。因此，15-LOX-1通過降低生長因子的mRNA水平、NO的生物活性、VEGFR2的表達而發揮其抗血管新生的功能。Vitia等[33]進一步在新西蘭大白兔玻璃體腔內通過腺病毒介導15-LOX基因轉染，發現VEGF-A顯著增加兔眼的微血管的數量和尺寸，而15-LOX-1通過抑制VEGF-A的表達顯著抑制VEGF-A的促進血管新生和血管變異性改變和由此引發的眼病理變化作用，提示玻璃體腔內15-LOX-1基因轉染可能成為治療眼部新生血管并發癥的新策略。

最新研究[34]顯示，在視網膜微血管內皮細胞實驗中，缺氧可引起細胞增殖能力及VEGF-A、VEGF-R2的表達增加，15-LOX-1和PPAR-γ的表達下降，而15-LOX-1可通過抑制缺氧引起的VEGF家族及PPAR-γ與VEGFR2的作用，而抑制缺氧引起的視網膜新生血管形成。在體內實驗中，高氧誘導小鼠視網膜新生血管病變模型中也證明相比對正常小鼠，缺氧小鼠視網膜內15-LOX-1mRNA的表達下降20%，蛋白表達顯著減少42%，而通過腺病毒轉染15-LOX-1使視網膜過度表達15-LOX-1后，則可抑制視網膜新生血管形成[35]。

綜上所述，脂氧合酶家族中5-LOX和12-LOX可能通過影響VEGF、MPPS、整合素及bFGF等因子的表達從而參與新生血管形成的各個階段，包括增加血管內皮細胞的通透性，崩解血管基底膜和細胞外基質，引起內皮細胞遷移、增殖出芽、管腔形成，而15-LOX主要表現的是減少VEGF及相關因子的表達而發揮抑制血管新生的作用。目前一些脂氧合酶相關的制劑已開始運用于腫瘤、自身免疫性疾病、血液病、糖尿病視網膜病變等的治療，并且取得較好治療效果，其應用前景廣闊。但是脂氧合酶及催化產物在新生血管中的治療作用尚處于探索階段，其確切的作用效果和作用機制還待大量的研究進一步證明其有效性和安全性。LOX相關制劑單獨或是與其它治療措施聯合應用，或有可能成為治療新生血管性疾病的有效安全的新方法。

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（收稿：2014-04-16 修回：2014-05-18）

1浙江省麗水市人民醫院眼科（麗水 323000）；2武漢大學人民醫院眼科中心（武漢 430060）

胡夏云，Tel：18957093503；E-mail：huxiayunzj@163.com