青藤堿的免疫抑制作用機制的研究進展

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(南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，湖南 衡陽 421001)

·文獻綜述·

青藤堿的免疫抑制作用機制的研究進展

黎煉1，羅志剛2*

(南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，湖南 衡陽 421001)

器官移植是治療終末期器官衰竭的最有效手段，但移植后的免疫排斥反應始終是移植面對的難題。目前的免疫抑制劑毒副作用大，明顯降低了其治療效果，尋找更好的防治移植排斥反應的方法是移植界的研究熱點。青藤堿是從中藥防己科植物青風藤中提取的一種生物堿,具有免疫抑制和抗炎作用，是一種有良好應用前景的新型免疫抑制劑。

青藤堿； 免疫抑制； 器官移植

器官移植是治療終末期器官衰竭的最有效手段，手術(shù)后患者需長期服用免疫抑制劑以維系供體功能。目前的免疫抑制劑，缺乏特異性和選擇性，使用時全面抑制機體的免疫功能，其中不少種類的藥物僅在接近中毒量時才具有抑制免疫的效應，而且這類藥物價格昂貴，部分患者因難以承擔高昂的治療費用而中斷治療。此外，患者極易因藥物誘發(fā)腫瘤、機會菌感染及移植物失功等嚴重毒副作用，導致貧血、肝炎、糖尿病及骨病等不良反應。尋求安全低毒、有效、價廉的免疫抑制劑，始終是移植界需努力解決的目標。青藤堿(Alkaloid sinomenine，SIN)是從中藥防己科植物青風藤中提取的一種生物堿單體,具有抗炎和免疫抑制等藥理作用,臨床上主要用于對類風濕性關(guān)節(jié)炎等各種風濕病以及心律失常的治療。近年來隨著對其免疫抑制作用研究的逐步深入,青藤堿也應用于移植免疫研究。

1 對免疫細胞的影響

免疫反應的產(chǎn)生首先是由抗原提呈細胞(APC)捕獲抗原，經(jīng)其加工處理后將抗原信息傳遞給T、B淋巴細胞,從而引發(fā)一系列的特異性免疫應答。因此，在研究免疫反應時，抗原提呈細胞及其效應細胞如T、B淋巴細胞都是極其重要的研究對象。

1.1 對T細胞的影響

T細胞作為免疫反應的效應細胞，一直是器官移植界研究的熱點。移植抗原有間接和直接兩種識別途徑。直接識別途徑即受體T細胞直接識別供體APC的MHC類分子，從而誘發(fā)免疫應答，在早期排斥反應中起到關(guān)鍵作用。間接識別途徑指受體T細胞識別自身APC處理過并遞呈的供者特異性抗原，從而引發(fā)的免疫應答，在器官移植免疫遠期起主要作用。

CD4+T細胞的活化是移植免疫發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，一旦其充分活化，將產(chǎn)生眾多的細胞因子，協(xié)調(diào)移植免疫反應的多種效應。李建軍等[1]研究青藤堿(SIN)對CD4+T細胞內(nèi)核因子-AT(NF-AT)和γ干擾素(IFN-γ)表達的影響，發(fā)現(xiàn)青藤堿能抑制CD4+T細胞的NF-AT和IFN-γ表達，并推測其可能是通過降低NF-AT的表達以抑制T淋巴細胞的活化和增殖。有研究[2]發(fā)現(xiàn)SIN能濃度依賴性地抑制人外周血CD4+T淋巴細胞增殖和細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，人外周血CD4+T淋巴細胞增殖抑制率和細胞內(nèi)Ca2+濃度之間存在顯著性負相關(guān)。SIN可抑制CCP-AST的體外活化、增殖[3]，并抑制其分泌IFN-γ水平，上調(diào)IL-4的表達[4]。SIN能顯著降低腎移植小鼠外周血T淋巴細胞計數(shù)，主要抑制CD4+T細胞，對CD8+T細胞計數(shù)無明顯影響，能降低CD4+T/CD8+T比值，并與環(huán)孢素A(CsA)有協(xié)同作用[5]。

調(diào)節(jié)性T細胞，全稱CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Regulatory T Cells，Treg)，具有免疫抑制和免疫無能性。活化的Treg可以廣泛抑制體內(nèi)多種細胞的增殖[6]，如CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷T細胞、B細胞、DC、單核巨噬細胞等的活性。包括天然調(diào)節(jié)性T細胞(natural occurring regulatory T cell,nTreg)和誘導性調(diào)節(jié)性T細胞(induced regulatory T cells,iTreg)，近年來成為研究免疫反應的熱點。Treg二者表達相似的膜表型分子，發(fā)揮類似的免疫抑制功能。在自身免疫疾病方面，iTreg能明顯抑制實驗性腸炎的發(fā)生[7]。疫苗誘導的iTreg可以預防和治療Feldl引起的呼吸道過敏反應[8]，對于nTreg無治療效果的Th17介導的自身免疫性胃炎發(fā)展的后期，抗原特異性iTreg也可能通過分泌趨化因子調(diào)節(jié)T細胞的遷移，最終逆轉(zhuǎn)組織損傷，改善組織的功能[9]。Foxp3特定表達在細胞內(nèi)，是Treg發(fā)育活化發(fā)揮功能的關(guān)鍵，并且不受活化狀態(tài)的影響，被公認為是Treg的特異性標志。Treg的抑制效應具有劑量依賴性，Treg比例越大，其特征分子Foxp3表達越高，抑制功能越強[10]。調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生和功能的維持所需的最為重要細胞因子是TL-2、TL-10與TGF等。蔡振剛等[11]建立大鼠肝移植模型，探討SIN、CsA及兩者聯(lián)合應用對其的影響，發(fā)現(xiàn)SIN聯(lián)合半量CsA促進IL-10分泌強于CsA組，同時促進了肝內(nèi)淋巴細胞的凋亡，減輕了肝臟的病理損害。李凝等[12]分別抽取SIN組和雙氯酚酸鈉組RA患者治療前、治療后以及對照組健康體檢者的外周靜脈血，從細胞層面探討SIN對輔助性T淋巴細胞(Th)17/調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Tregs)細胞比例的影響，發(fā)現(xiàn)SIN能抑制致炎細胞Thl7升高，提高具有免疫抑制作用的Tregs細胞數(shù)量。有實驗[13]也發(fā)現(xiàn)SIN聯(lián)合MTX治療RA患者外周血中Treg水平明顯升高而Thl7細胞含量明顯降低，上述實驗均提示SIN能上調(diào)Treg的數(shù)量，提示SIN具有免疫抑制作用。

1.2 對B淋巴細胞的影響

B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，主要調(diào)控體液免疫。在器官移植界，細胞性免疫一直被認為主導移植排斥反應。隨著抗體檢測技術(shù)敏感性的逐漸提高，抗體在移植免疫中逐漸被重視。器官移植領(lǐng)域的國際知名專家Paul Terasaki綜述了器官移植的體液免疫進展[14]，發(fā)現(xiàn)：(1)幾乎所有的腎移植失敗患者都發(fā)現(xiàn)存在HLA抗體，HLA抗體能引起腎移植的超急性排斥反應；(2)導致與早期腎移植失敗相關(guān)的C4d在腎小球沉積，最后他得出了抗體是引發(fā)排斥的元兇這一結(jié)論。其在其另外一篇文獻[16]中總結(jié)到，不同的實體器官移植均存在抗體相關(guān)排斥反應，且抗體出現(xiàn)在排斥發(fā)生前，說明抗體是器官移植排斥的原因。秦寧波等[16]根據(jù)接受誘導劑的不同將患者分為3組：淋巴細胞清除劑組；IL-2受體拮抗劑組及對照組，比較3組在1年內(nèi)的排斥發(fā)生率和其他檢測指標。發(fā)現(xiàn)急性排斥反應的發(fā)生率淋巴細胞清除劑組和IL-2受體拮抗劑組較對照組明顯降低。

1.3 對樹突狀細胞(DC)的影響

樹突狀細胞是目前已知功能最強的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)，調(diào)節(jié)多種效應細胞的功能并在調(diào)控免疫應答中起核心作用。根據(jù)其成熟程度的不同分為成熟樹突狀細胞(mature dendritic cell,mDC)和未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell，imDC)。mDC表面顯著表達MHC分子、共刺激分子、粘附分子,體外激發(fā)同種異體淋巴細胞反應能力很強,是導致移植排斥反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。imDC表面表達低水平的共刺激分子和黏附分子。高永翔等[17]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿刺激后的DC細胞表達HLA-DR、產(chǎn)生細胞因子和刺激同種同基因T細胞增殖的能力顯著低于正常DC細胞，提示青藤堿可抑制DC的發(fā)育成熟和免疫應答功能。楊承英等[18]研究結(jié)果表明，合適劑量的SIN能刺激單核細胞分化為imDC，還能抑制其進一步成熟。

1.4 對單核/巨噬細胞(MO)的影響

單核細胞通過抗原提呈和釋放細胞因子直接或間接活化輔助性T細胞，進而活化B細胞產(chǎn)生大量抗體。MO來源于單核細胞，活化后的MO參與到移植排斥的各個環(huán)節(jié)，包括吞噬、處理和提呈抗原，作為效應細胞損傷組織，調(diào)節(jié)免疫和修復組織。MO分泌了一系列促炎細胞因子[TNF-α,干擾素(IFN)、IL-1,IL-6,IL-8,]和生長因子[如血小板源性生長因子(PDGFs)，轉(zhuǎn)化生長因子β，成纖維細胞生長因子和血小板活化因子等]導致組織損傷和組織硬化。青藤堿能呈濃度依耐性地提高巨噬細胞吞噬指數(shù)和吞噬率,降低巨噬細胞TNF-α、IL-6的表達，提示青藤堿能顯著提高巨噬細胞吞噬能力[19]。有研究[20]發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿對小鼠腹腔巨噬細胞的配體刀豆素A和酵母多糖A內(nèi)吞作用的影響時，發(fā)現(xiàn)當細胞外液含有SIN時，巨噬細胞內(nèi)吞效應受到顯著抑制。

2 對免疫分子的影響

免疫分子包括細胞因子、粘附因子、趨化因子等，其在免疫應答反應中發(fā)揮不可或缺的作用。目前青藤堿主要以細胞因子和粘附因子為研究對象。

2.1 對細胞因子的影響

細胞識別抗原后，產(chǎn)生細胞因子。IL-2、IFN-γ、IL-12等促使免疫細胞向Th1方向偏移，同時抑制Th2亞群分化，使應答偏向細胞性免疫，在移植界構(gòu)成了細胞性急性排斥的基礎(chǔ)。反之，IL-4、IL-5等促進Th2細胞發(fā)展，抑制Th1細胞增殖，發(fā)揮相應的免疫效應。Th1/Th2間的是否互相平衡直接影響機體的免疫功能。陳哲等[21]在研究青藤堿對變應性鼻炎的療效及其作用機制時，發(fā)現(xiàn)青藤堿能降低變應性鼻炎的小鼠血清中Th2細胞因子IL-4及Thl細胞因子IFN-γ水平，且下降幅度以IL-4為顯著。而程悅[22]在研究SIN對系膜增生性腎炎T細胞免疫失衡的調(diào)節(jié)作用時，也得出SIN能抑制Thl細胞因子IFN-γ的表達這一結(jié)論，并進一步發(fā)現(xiàn)SIN的這種調(diào)節(jié)作用隨著SIN濃度的增加、治療時間的延長而增強。IL-12是已知誘導Th1類應答的主要因子,誘導T細胞產(chǎn)生Th1類細胞因子IFN-γ和IL-2,而成為效應性T細胞。SIN可抑制樹突狀細胞分泌IL-12。能夠抑制混合淋巴細胞反應中淋巴細胞的增殖和增強骨髓充質(zhì)干細胞(BMMSCs)免疫調(diào)節(jié)能力，其作用機制可能與促進Th2細胞因子分泌以及抑制Th1細胞因子分泌有關(guān)[23]。

炎癥壞死或凋亡是細胞死亡的主要方式，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、干擾素γ(IFNγ)等參與了腎臟免疫性炎癥的發(fā)病機制。SIN可明顯降低TNF-α表達[24]，還抑制IL-10，抗dsDNA抗體蛋白含量和IL-10，TNF-αmRNA表達[25]。而有報道提出，白細胞介素6的表達水平與移植物的損傷程度存在一致性[26]。廖懷德等[27]建立大鼠腎移植模型，研究青藤堿對腎移植大鼠靜脈血IL-6的影響，證實了青藤堿對大鼠移植腎起了比較確切的抗急性排斥反應，能明顯下調(diào)IL-6的質(zhì)量濃度并與環(huán)抱素A存在協(xié)同作用。

2.2 對粘附因子的影響

在器官移植排斥反應中多種粘附分子參與了免疫應答，ICAM-1是淋巴細胞功能相關(guān)抗原(LFA-1)的配體，通過ICAM-1與LFA-1的結(jié)合,參與抗原提呈反應。檢測移植器官組織ICAM-1的表達水平可反映SIN對器官移植急性排斥反應的抑制程度。戴英波等[28]建立大鼠同種腎移植模型，研究SIN的免疫抑制作用及其與環(huán)抱菌素A(CsA)的協(xié)同效應，并探討SIN免疫抑制作用的機制，觀察到SIN可能通過下調(diào)ICAM-1表達抑制大鼠腎移植的急性排斥反應，并與CsA產(chǎn)生顯著的協(xié)同作用，可減少CsA的用量，從而減輕其對移植腎的毒副作用。方敬[29]則改良大鼠模型，觀察腎小球以及腎小管—間質(zhì)的病理改變情況，采用免疫組織化學法檢測ICAM-1的表達并分別進行半定量分析，實驗表明青藤堿能夠有效減輕腎臟病理損害，抑制大鼠腎組織ICAM-1的表達，延緩疾病進展。

2.3 SIN對核因子kB的影響

核因子-κB(NF-κB)是從B淋巴細胞核抽提物中檢測到的核蛋白因子，其能通過調(diào)節(jié)許多蛋白如細胞因子、急性期反應蛋白和細胞粘附分子等的表達來調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應。活化后的NF-κB，能調(diào)節(jié)多種細胞因子表達增加,如腫瘤壞死因子TNFα、白細胞介素IL-1、IL-6、IL-8、細胞間粘附分子ICAM-1等，影響機體的炎性反應，調(diào)控T、B淋巴細胞的增殖、生長和分化，在體液和細胞免疫中發(fā)揮重要作用。王春等[30]探究SIN對NF-KB核轉(zhuǎn)位及IKBct降解的影響，發(fā)現(xiàn)SIN基本上把NF-KB阻滯在細胞質(zhì)中，而細胞經(jīng)脂多糖處理1h后，大部分NF-KB被轉(zhuǎn)運到細胞核中，經(jīng)SIN預處理細胞的細胞質(zhì)中NF-KB含量為脂多糖組的2倍；脂多糖處理細胞1h后，50%的IKBc降解，但經(jīng)SIN預處理細胞后，呈濃度依賴性抑制脂多糖誘導IKBa的降解。提示SIN可能通過阻斷NF-KB的核轉(zhuǎn)位以及IKBct的降解來抑制脂多糖誘導的人牙齦成纖維細胞IL-8的合成。姜浩等[31]在實驗中發(fā)現(xiàn)SIN在一定程度上抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜NF-kB的活化，該作用可能通過降低DR中氧化應激水平的機制，抑制了蛋白激酶的激活來實現(xiàn)。

利用免疫抑制及抗炎的特性，青藤堿已在臨床應用于風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎以及相關(guān)疾病脊椎炎和骨質(zhì)增生的治療，且療效確切，副作用少，價格低廉，來源廣泛。多個實驗從免疫反應發(fā)生的不同環(huán)節(jié)驗證了適當濃度的SIN具有良好的免疫抑制作用。完善青藤堿毒副作用機理及藥代動力學研究，盡早應用于器官移植領(lǐng)域，已成為移植學界和制藥界的目標，相信在不久的將來青藤堿有望成為推廣使用的新型免疫抑制劑。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.022

2014-07-07；

2014-11-14

國家自然科學基金資助項目(81273754).

*通訊作者，E-mail:luo6398@sina.com.

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(此文編輯：蔣湘蓮)