表觀遺傳學與哺乳動物配子和胚胎發生發育的研究進展

李美姿姜夢迪黃 楷綜述 丁之德審校

1. 上海交通大學醫學院2012級臨床醫學系（上海 200025）；2. 上海交通大學醫學院解剖學與組織胚胎學系

表觀遺傳學與哺乳動物配子和胚胎發生發育的研究進展

李美姿1姜夢迪1黃 楷1綜述 丁之德2審校

1. 上海交通大學醫學院2012級臨床醫學系（上海 200025）；2. 上海交通大學醫學院解剖學與組織胚胎學系

表觀遺傳學是指在細胞有絲分裂或減數分裂中未經DNA序列變化所引起的基因功能發生遺傳學改變的學說。它的研究現已跨越了生物學和醫學的許多不同領域。近年來，表觀遺傳學在生殖醫學的研究中發展迅速，如在配子和胚胎形成過程中包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA調控等修飾。其中，DNA的甲基化調控包括高甲基化、低甲基化、從頭甲基化和去甲基化，在此過程中需要甲基化酶如DNMT或去甲基化酶的調控；組蛋白修飾則是在組蛋白的氨基酸殘基上所進行的諸如甲基化、乙?；?、泛素化以及巴豆酰化等一系列改變以及組蛋白本身在配子或胚胎形成過程中的變化；RNA調控包括配子形成過程的轉錄后調控和非編碼RNA所扮演的各種不同角色。本文將根據近年來表觀遺傳學在生殖領域的研究進展作相關綜述。

一、表觀遺傳與精子

（一）DNA甲基化

DNA甲基化（methylation）是哺乳動物實施基因調控和轉座子(transposons)沉默的典型性表觀遺傳修飾。它通?？梢酝ㄟ^直接修飾位于CpGs(CpG雙核苷酸序列)的胞嘧啶殘基（5-mC）來調節基因轉錄。Molaro等[1]研究表明，在人類精子基因組中，96%的CpGs均有甲基化修飾。在此過程中，DNA甲基轉移酶（De novo methylation transferase，DNMT）家族扮演著不可或缺的角色——從頭甲基化（de novo methylation）和甲基化維持（maintenance methylation）。從頭甲基化是指不依賴已有的甲基化DNA鏈，而是在一個新位點上將DNA鏈中的胞嘧啶C5甲基化，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），與維持甲基化對應。直接負責從頭甲基化的酶包括DNMT3A（DNMT3a），DNMT3B （DNMT3b）和DNMT3L（DNMT3l）。DNMT3A和DNMT3B均含有催化結構域，使之能對靶基因位點直接甲基化，而DNMT3L則與DNMT3A和DNMT3B相互協調決定適當的甲基化位點。當甲基化標記相繼成立，DNMT1可在細胞分裂中維持這些標志。

甲基化在生殖細胞中一個重要作用就是沉默特定的基因，從而形成大部分印記基因（imprinted gene）。哺乳動物細胞印記基因來自于親代遺傳下來的表觀遺傳標志[2]。在雄性精子中，只有少部分基因被發現具有父系印跡，包括IGF2/H19、RASGRF1和GTL2位點[3]。

（二）組蛋白修飾

雄性生殖細胞在生長發育中通過核凝聚來更好的完成后續發生的精子入卵過程，因此需要特定的后天修飾，而如此嚴苛的體積控制有利于父系DNA入卵的有效性和安全性。該過程需要精子特異核蛋白——魚精蛋白（protamine）來完成，它能通過中和DNA的負電荷使染色質結合得更緊密。精子中組蛋白（histone）與魚精蛋白之間的替換是一漸進過程。首先，一些典型的組蛋白被睪丸特異性組蛋白變體所代替；隨后，90%左右的組蛋白被過渡蛋白（transition protein, TP）代替；最后，魚精蛋白替代過渡蛋白完成整個替換過程，至此形成緊密裝配的精子細胞核。

在精子形成過程中，組蛋白變體（histone variant）的地位十分重要。然而，在組蛋白至魚精蛋白的替換中，還需要進行大量的組蛋白乙?；╝cetylation）過程。有趣的是，乙酰化可能又是睪丸蛋白降解的標志，數據顯示乙酰化的睪丸蛋白通過乙?；蕾囃緩蕉皇欠核鼗╱biquitination）依賴途徑進行蛋白降解[4]。精子形成中組蛋白的泛素化修飾與體細胞中的蛋白降解過程也不同，它能夠通過RNF8（E3泛素化連接酶）依賴途徑沉默性染色體。RNF8基因敲除的小鼠睪丸顯示組蛋白泛素化抑制和H4K16乙?；瘡U除，由此可見，組蛋白泛素化和乙?；歉叨嚷撓档倪^程[4]。

組蛋白甲基化是由組蛋白甲基轉移酶（histone melthyltransferases，HMT）催化，常發生在H3、H4組蛋白N端賴氨酸或精氨酸殘基，包括單甲基化、雙甲基化和三甲基化。組蛋白甲基化參與轉錄調控、基因組完整性維持及表觀遺傳模式的傳遞。不同的甲基化模式扮演著不同的角色，如H3K4me3（活化模式）或H3K27me3（抑制模式），它們分別標志著不同的父系基因啟動子，活化模式為精子形成過程基因表達所需，而抑制模式則扮演著調節子的角色[5]。

（三）精子RNA

對于精子來說，遺傳信息準確的時空表達對于其正常發生和發育極為重要，一般調控主要發生在轉錄和表觀遺傳水平。mRNA的命運主要由

NA結合蛋白（RNA binding protein）控制，人體內有多種不同的RNA結合蛋白，其中有睪丸特異的

NA結合蛋白。它們在減數分裂和減數分裂前期的細胞中合成并通過識別靶mRNA形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）復合物參與mRNA調節[6]。

由于精子在染色質濃縮前也存在活躍的基因表達，其中的非編碼RNA如Dicer酶依賴性小RNA （Dicer-dependent miRNA）和Dicer酶無關的piRNA （Dicer-independent PIWI-interacting RNAs）也逐漸為人們所了解[7]。性染色體上的基因通常在減數分裂Ⅰ期時就隨著性染色體失活而沉默，而X染色體上miRNA基因簇所編碼的產物似乎為進化所青睞，以致其逃過性染色體失活而重現表達。雄性小鼠在早期生活中如遭遇壓力將會改變其精子中miRNA表達，并可能將相應的抑郁癥狀遺傳給后代[8]。而對于iRNA研究顯示，它是一類與PIWI蛋白聯合發揮作用的RNA，在精子形成中，PIWI通路在沉默轉座子方面具有特殊的作用[9]。另一方面，精子的正常發育及受精后精子在卵子中表達相關蛋白以保護自身的遺傳信息都與轉座子的調控密不可分。

（四）精子的表觀遺傳與男性不育

隨著精子的表觀遺傳修飾不斷被證明，許多新技術也被應用于探索其對男性不育所造成的影響。甲基化已成為研究最多的領域，現已發現有許多基因啟動子的超甲基化（hypermethylation）被證實與男性不育有關，如：MTHFR，PAX8，NTF3，FN，HRAS，JHM2DA，IGF2，H19，RASGRF1，

TL2，PLAG1，D1RAS3，MEST，KCNQ1，LIT1 和SNRPN等[10]。精子染色質重塑過程中兩種魚精蛋白比例P1:P2的紊亂也為男性不育的因素之一，同時在輔助生殖時也可作為精子質量的檢測指標[11]。此外，組蛋白修飾的紊亂和RNA的相關變化也均與男性不育有一定的相關性。

二、表觀遺傳與卵子

（一）DNA甲基化

在原始生殖細胞中會發生基因甲基化的清除，而在此之后，全基因組的從頭開始甲基化以及在印記位點的等位基因（allelic genes）建立起特異性標記[12]。對于雌性來說，從頭甲基化是在卵細胞進入卵泡發育生長階段獲得的，發生于初級卵泡至竇狀卵泡時期，并且印跡基因甲基化與卵細胞大小相關，即隨著卵泡直徑增加甲基化水平也相應增加[13]。受精后至桑葚期前，母系基因組再被動的發生去甲基化（demethylation）[14]。

卵細胞的發育成熟中，通過對其DNA中CpG島的甲基化和去甲基化調控很多關鍵基因的表達，如在性激素的合成以及卵細胞對其敏感性方面，多梳蛋白家族基因（Polycomb group，PcG）中Eed和Cbx7其啟動子甲基化會解除對kiss1基因的抑制以促進青春期開始，使GnRH呈正常的脈沖式釋放[15]。另外，該甲基化對類固醇合成基因的調節也較多見，如低濃度雙酚A（bisphenol A）可使Star基因轉錄起始位點的CpG島甲基化水平發生改變，同時可通過核受體5a1s（nuclear receptor, Nr5a1s），也稱類固醇合成因子1（steroidogenic factor-1，Sf-1）來調節類固醇的合成，促進性腺發育，引發性早熟[16]。

（二）組蛋白乙?；?/p>

從卵細胞發育中期開始，轉錄逐漸降低，完全成熟的卵細胞幾乎沒有轉錄活性，因此，對于卵細胞發育能力的獲得，轉錄沉默（transcription silencing）是必要的，并且它與染色質緊縮和組蛋白轉錄后修飾（Post-transcriptional Modification，PTM）有關。PTM含磷酸化（phosphorylation）、甲基化、泛素化和乙酰化修飾，尤其以組蛋白乙?；^為多見。

組蛋白中賴氨酸乙酰化調節由組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）協調完成。HDACs可以對組蛋白和其他蛋白進行去乙酰化，如微管蛋白和轉錄因子TRP53（P53）等。哺乳動物的HDAC有18種，分為4類。HDAC2是卵細胞發育中主要的組蛋白乙酰化調節酶，也是H4K16主要的去乙?；?。在HDAC2缺乏的卵細胞中，H4K16乙?；砍试黾于厔莶p害著絲點即動粒的功能，因為突變卵細胞的動粒較少能形成穩定的微管連接，造成MII期卵細胞染色體的分離障礙，這表明HDAC2在染色體分離中具有重要作用[17]。Hdac1和Hdac2都缺失時，卵泡發育就會停滯在次級卵泡期，H3K4的甲基化明顯降低，同時在突變的卵細胞中TRP53乙?；裁黠@增加，凋亡率增高[18]。此外，最近發現的視網膜母細胞瘤相關蛋白7（Retinoblastoma associated protein 7, RBBP7）含組蛋白去乙?；?，這是一種來自母體休眠的mRNA（dormant maternal mRNA），在卵細胞成熟時其關鍵蛋白轉譯中被招募以調節組蛋白乙酰化，尤其是小鼠卵細胞染色體的減數分裂成熟中在其特異組蛋白的去乙?；{節中起關鍵作用[19]。

（三）miRNA作用

microRNAs（miRNAs）在卵泡發育和成熟調節中扮演了重要的角色，如敲除雌鼠Dicer1基因后，可抑制該miRNA生成且首次發現其在卵泡生長和子宮功能調節中發揮著特殊的作用。隨后有一系列miRNA的具體功能被發現：（1） MiR-133b在卵細胞生長成熟中受到IGF-1信號通路調控，并調節肌動蛋白TAGLN2的表達[20]；（2）miR-21可阻斷排卵前小鼠卵泡顆粒細胞凋亡,維持黃體功能[21]，并通過著床前調節PTGS2和RECK基因表達以調控雌激素和孕酮對子宮的作用，保證著床的準確性；（3）miR-383通過靶向Rbms1使c-Myc失活以促進類固醇激素的合成[22]。

（四）表觀遺傳在雌性生殖中的應用

很多表觀遺傳的標記可作為人工輔助生殖的測評指標[23]。而對卵泡發生中的表觀遺傳變化進行研究，可更好的模擬體內自然過程，增加人工輔助生殖的成功率[24, 25]，減少倫理和經濟上的風險且提高人口素質[26, 27]。另外，對于一些表觀遺傳關鍵過程的調控和維持還可成為某些生殖系統疾病甚至腫瘤治療的新方法[28]。而相對遺傳信息影響較小的miRNA，更可應用于一些避孕藥物的研發[29]。

三、表觀遺傳與胚胎

（一）DNA甲基化和去甲基化

從頭甲基化酶DNMT對胚胎的影響主要有：（1）Dnmt1，在小鼠原腸胚形成前或過程中，敲除其Dnmt1會導致DNA甲基化水平廣泛降低，直至死亡；（2）Dnmt3，其中Dnmt3b在囊胚期顯著表達。敲除Dnmt3b基因將導致胚胎死亡，而Dnmt3a敲除卻部分可行。Dnmt3l缺乏雖有DNA甲基轉移酶活性的結構域，但作為Dnmt3a和Dnmt3b必需的輔助因子，Dnmt3l基因敲除小鼠可存活，但缺乏從頭DNA甲基轉移酶完整性會導致雄性不育和無母系遺傳障礙的小鼠胚胎死亡。

（二）組蛋白修飾

組蛋白修飾作為調控基因表達的重要機制, 可影響下游蛋白的表達及功能的發揮,進而決定了細胞的狀態，影響胚胎的發生和發育。如組蛋白乙?；瘜τ谂咛グl育十分重要，敲除組蛋白乙?；窰ATs家族的不同成員，小鼠胚胎發育會嚴重受阻，表現為缺少特異性脊索中胚層和軸旁中胚層分化來的胚胎結構，如嚴重的顱神經管閉合缺陷、心臟發育缺陷等。在去乙?；窰DAC家族中，HDAC1，HDAC2和HDAC3在小鼠胚胎發育后期均有較強表達，在植入前早期的胚胎中HDAC1表達更強，并且HDACs時序性規律的表達對小鼠腸的發育至關重要，同時還可參與胚胎心臟和骨骼肌的發生[30]。

除此外，組蛋白甲基化也在胚胎發生和發育中發揮著重要作用。研究表明，小鼠胚胎早期WDR82 （HMT復合體的亞基之一）基因沉默，將引起轉錄因子POU5F1基因的轉錄起始位點H3K4me3減少，并伴隨著胚泡細胞數目減少、胚胎細胞凋亡及胚胎發育遲緩等現象發生[31]。

（三）miRNA與胚胎發生和發育

哺乳動物胚胎的正常發育需要廣泛的基因轉錄阻滯和母源性轉錄產物mRNA的清除，這一過程與胚胎基因組的激活即母體至受精卵轉化（maternal to zygote transition，MZT）相一致。MZT進程中，母源性mRNA的清除正是通過3’UTR區域的相關作用實現的，而miRNA在此過程中發揮動態調節作用。研究表明，DNA甲基化和組蛋白修飾作為表觀遺傳經典調節方式影響miRNA的表達。反之，miRNA也可通過調節DNMT來調控DNA甲基化：miR-148a與miR-148b以DNMT3b的mRNA某一編碼區為靶點，抑制DNMT3b的表達；而miRNA-140、miRNA-1與HDAC4基因的3’UTRs結合，也可抑制其基因表達。在臨床宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）胎兒的臍血CD34+干細胞中，檢測到肝細胞核因子4α基因（HNF4A gene）啟動子區的DNA發生甲基化修飾改變，這是幼年速發2型糖尿病發病的重要誘因之一[32]。其機制是HNF4A基因涉及胚胎時期肝臟和胰腺的功能發育，并且與這兩種組織中許多代謝通路的基因表達主動協調相關。

四、總結與展望

由于在生殖細胞的發生中表觀遺傳的表現各有特點，因此對精子和卵細胞的表觀遺傳學研究也就各有重點。在胚胎期，由于受精后各種標記需重新建立，同時又受到親代配子的影響，所以其變化更為復雜。目前表觀遺傳對生殖影響的研究除了廣泛的探索和描述外，對其機制和信號通路的研究已逐漸成為熱點，但具體的環節還亟待完善，而這也正是表觀遺傳學的研究成果應用于生物學與臨床醫學的基礎。

致謝：本文由上海交通大學醫學院第八期大學生創新項目（2014011）基金項目資助

關鍵詞哺乳動物; 表觀遺傳; 配子發生; 胚胎發育

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（2014-09-05收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.017

中圖分類號Q 953