人乳腺癌干細胞異種移植動物模型研究進展

人乳腺癌干細胞異種移植動物模型研究進展

戴璟，謝茂云 綜述，黃耀*審閱

(廣東醫學院福田醫院 外科,廣東 深圳518048)

乳腺癌作為一種嚴重威脅女性健康和生命安全的惡性腫瘤[1]。近45年來，乳腺癌的發病率在世界各國均呈上升趨勢[2]。全世界每年新發乳腺癌約100萬例，死亡約60萬例[3]。乳腺癌的預防、診斷和治療已經成為當今醫學及生物科學研究的“熱點”。干細胞或祖細胞已有研究證明在腫瘤發生、發展過程中成為惡性轉化靶點的關鍵。腫瘤干細胞主要通過Notch,Wnt,Hedgehog等三條通路調解自我更新的信號傳導[4-8]，如Notch途徑的激活會導致細胞命運的改變；wnt信號轉導途徑的激活促進了上皮干細胞向上皮癌轉化；Hedgehog信號通路在大多數乳腺癌中被激活，過度表達PTC1和GLI1(Hedgehog信號通路激活標記物)。上述通路的異常會導致正常乳腺的干細胞發生惡性轉化，致使乳腺癌的產生。實驗動物模型已今已成為是研究乳腺癌干細胞生物學行為的重要工具之一。

1實驗動物的選擇

異種移植模型：人類乳腺癌細胞株移植于免疫缺陷動物體內而建立的動物模型[9]。免疫缺陷動物本身具有腫瘤移植成功率高，需求細胞數目少；移植瘤的病理學、生物學特征更接近人體的原發瘤等特點。人乳腺癌異種移植主要選取的動物有重癥聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠、裸鼠[10]。

1.1SCID小鼠模型鑒于SCID小鼠缺乏T和B淋巴細胞的特點，對體外移植物免疫排斥能力較低，為國內外學者在腫瘤生物學研究方面引起普遍重視。SCID小鼠建立的移植動物模型已廣泛見于T和B細胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝細胞癌、結腸粘液腺癌和肺癌等。上述研究結果均顯示SCID小鼠造模優于裸鼠[11-13]。葉麗虹等采用經胰酶消化的人乳腺癌MCF-7細胞懸液接種于SCID小鼠腋背皮下，每只接種0.2 ml，6-10天接種部位出現質硬腫瘤結節，成瘤率為5/5只，成瘤潛伏期為(7．4±1．3)d[14]。

1.2NOD/SCID小鼠非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交后獲得NOD/SCID小鼠[15]。Beckhove等將MCF-7細胞株移植入NOD/Lt-SCID小鼠體內，不經射線照射，成瘤率大于 90%，經觀察數天瘤體內顯示有新生血管生成，各項腫瘤標志物的表達呈正相關性變化，建立了較好的模擬腫瘤的生長環境，提供檢測新的抗癌治療方式或藥物的良好模型[16]。

1.3裸鼠胰酶消化后的MDA-MB-231和SK-BR-3細胞，用Hank液清洗2次，錐蟲藍染色，于雌性裸鼠左側腋窩皮下接種0.2 ml/只。MDA-MB-231移植瘤5天潛伏期后，接種皮下可見灰白色結節，腫瘤接種成功率為90%。SK-BR-3移植瘤11 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結節，腫瘤接種成活率80%[17]。朱瑋等將攜帶熒光素的酶(leu)基因的乳腺癌細胞MDA-MB-231-lue于裸鼠下腹部乳腺脂肪墊內注射50 μl，裸鼠腹腔注射熒光素，進行光學成像檢測。第7天時活體內可見明顯發光，10天可見腫瘤病灶，腫瘤的平均體積在第2周到第5周時都呈上升趨勢，對腫瘤體積和光子數進行回歸分析，R2=0．901[18]。

2異種移植的制備方法

2.1人乳腺癌干細胞的發現與分離

2.1.1在對人乳腺癌干細胞的研究中的發現：乳腺癌干細胞在機體內存在自我更新及多向分化性潛能的細胞群體，可分化產生相應組織的成熟細胞，一個干細胞可通過對稱和非對稱分裂一個干細胞產生兩個子細胞，一個與母細胞完全一致，具有母細胞同樣的特征，故理論上可以發育成為完整的生物個體或組織器官[19]。腫瘤干細胞(tumor stem cells，TSCs)作為一種特殊類型的干細胞，其本身已具有：增殖能力高、自身的更新能力及多向分化等功能[19]。腫瘤干細胞與干細胞在其各自的生長過程中存在相關的調控機制,其中Wnt、Hedgehog、Notch通路的某些信號調節及傳導異常最終導致了腫瘤的發生[4-8]。AL-Hajj等首次發現了乳腺癌起源于癌干細胞的證據[21]，通過對人乳腺癌組織的分離，檢出表面有CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-標志的細胞,將這些細胞移植入NOD/SCID小鼠體內,證實了能夠產生明顯腫瘤的細胞亞群的存在，提示乳腺癌中存在促進腫瘤發展的腫瘤干細胞。

2.1.2人乳腺癌干細胞的分離人乳腺癌干細胞分離方面具有較多的實驗方法和實驗方式，如通常采用的乳腺癌干細胞的分離方法：表面標志分選、流式細胞儀側群分流、無血清懸浮培養等方法[22]。AL-Hajj等首次分離出表面標志為CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-的實體腫瘤干細胞[21]。Liu[23]等利用表面標志CD44+、CD24-/low的細胞檢測乳腺癌患者預后情況，發現這些細胞與患者的生存期和腫瘤復發相關聯。在長時間的體外培育中，人乳腺癌干細胞在培育過程中其表面標志物發生改變。研究者又從人乳腺癌MCF-7細胞系分離出CD55high、CD55low細胞，其中CD55high細胞具有分化能力進一步加強趨勢，展現CD55high細胞更具備腫瘤干細胞的生物性狀[24]。側群(side population,SP)分選利用干細胞帶有特異性膜蛋白，如ABCG2(breast cancer resistance protein)，使其不能被DNA增補性染料Hoechst33342染色的特點進行干細胞分離。Patrawala[25]等在MCF7細胞株中分離出的SP亞群，SP亞群在致瘤性能力明顯超過非SP細胞，另SP亞群即可可傳代也可其他非SP細胞，充分顯示其具有自我更新和多向分化能力及具有癌干細胞特性。也有相關研究者應用無血清懸浮培養體系進行乳腺癌原代細胞培養，無需明確的細胞標志，獲取富集乳腺癌起始細胞的被稱作“乳腺球(manlmo-sphere，MS)”的克隆性非黏附細胞集落[26]。起源于單個細胞的乳腺球能夠分化成乳腺的多種不同的細胞系。鄭文博等采用乳腺球懸浮培養法從人乳腺癌的腫瘤組織中成功分離并富集了原代腫瘤細胞，通過對其進行：CD44、CD24、ALDHl，ESA以及Oct4的檢測，證實了其呈現腫瘤干細胞的表型[27]。由此可見，乳腺球懸浮培養法同樣能夠有效地分離并富集乳腺癌干細胞。

2.2造模方法

乳腺癌干細胞異種移植的動物模型分：為原代移植和細胞系移植兩類[10]。AL-Hajj等通過對人乳腺癌組織分離，成功提取表面標志為CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-的實體腫瘤干細胞[20],通過相應干細胞移植免疫缺陷小鼠的乳腺組織內經培養形成腫瘤,成瘤率近100%，培植腫瘤具有原發腫瘤的病理組織學特征。乳腺癌細胞系如MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3已廣泛應用到乳腺癌異種移植的動物模型中[11,15,17]。乳腺癌干細胞異種移植常接種于小鼠的乳脂墊(mammary fat pad)與腋背側皮下[28-29]。Price[30]等曾對比皮下接種和乳脂墊接種的差異，利用細胞株和MDA-MB-231、MDA-MB-435分別進行皮下注射接種和乳脂墊接種，發現乳脂墊接種后的成瘤率為100%，而皮下途徑為40%。

3評價與展望

目前，乳腺癌干細胞異種移植的研究仍存在一定程度的不足。由于技術上的限制，需要通過表面標志分選、流式細胞儀側群分流等方法對乳腺癌干細胞進行分離，未能找到對其富集、分離最佳方法。而異種移植模型仍存在缺乏人類乳腺癌組織中的間質細胞、缺少癌細胞周圍的三維結構、缺少對腫瘤細胞的免疫反應等缺點。綜上所述，乳腺癌干細胞是乳腺癌的起源,而乳腺癌干細胞動物模型的建立和研究，有助于更好地了解乳腺癌的生物學特性，選擇相應的乳腺癌干細胞進行針對性乳腺癌靶向治療,殺死腫瘤干細胞,將對乳腺癌預防、治療、預后起不可忽視的作用。

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收稿日期：(2013-11-16)

文章編號：1007-4287(2015)03-0519-03

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