高效液相色譜法在抗生素藥品有關物質分析中的應用

劉拴娣，趙媛媛

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050； 2.內蒙古自治區武川縣醫院，內蒙古 呼和浩特 011700）

高效液相色譜法在抗生素藥品有關物質分析中的應用

劉拴娣1，趙媛媛2

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050； 2.內蒙古自治區武川縣醫院，內蒙古 呼和浩特 011700）

抗生素是臨床使用最廣泛的藥品，其質量優劣直接關系著臨床使用的安全性和有效性，其有關物質的質量控制與臨床不良反應密切相關。高效液相色譜（HPLC）法為抗生素雜質檢查最常用的方法，具有簡便、快捷、準確等優勢。該文總結了HPLC法在抗生素藥品含量測定及有關物質檢查中的應用。

高效液相色譜法；抗生素；有關物質

藥品的質量與療效不僅與藥品本身固有的生物活性有關，還與藥品中的雜質成分有關。抗生素藥品因制備工藝、化學結構及組分等方面的特殊性，決定了其雜質更復雜。抗生素藥品中有關物質通常是指原料藥和制劑中的有機雜質，有關物質檢查在抗生素藥品質量控制中占有重要地位。由于各類抗生素半衰期不同，在存放時可能出現微量或痕量雜質，故選擇高效液相色譜（HPLC）法測定其有關物質臨床意義重大。目前，HPLC是檢查抗生素藥品中有關物質最常用的方法，具有簡便、快捷、準確等優勢。

1 β－內酰胺類

β-內酰胺類抗生素是抗生素藥品中極易因雜質引起過敏性反應的一類，其主要雜質有高分子聚合物、降解物及異構體等。王建等[1]采用梯度洗脫的方法檢測了鹽酸頭孢他美酯中的有關物質，該方法實現了鹽酸頭孢他美酯與中間體、分解產物及二聚物的完全分離，與2010年版《中國藥典（二部）》所載方法比較，檢出了更多雜質峰，且避免了主要雜質頭孢他美酸出峰快且易受溶劑峰和輔料峰等干擾的缺點。

李進等[2]比較了2010年版《中國藥典（二部）》和34版《美國藥典》中頭孢地尼有關物質的分析方法，對2種系統分離的雜質進行了相互識別和追蹤，結果6種主要有關物質色譜保留行為基本一致。從頭孢地尼合成工藝角度出發，對2010年版《中國藥典（二部）》中頭孢地尼有關物質分析方法進行了進一步優化，優化后的新方法解決了乙酰化頭孢地尼和反式頭孢地尼2種雜質的分離問題。

劉成紅等[3]對95家生產企業共380批次頭孢拉定膠囊中的有關物質進行了檢測，所建立的方法可有效分離與檢測各雜質峰，且更利于7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸和雙氫苯苷氨酸雜質峰的判別。測定結果顯示，2010年版《中國藥典（二部）》標準關于頭孢拉定原料與膠囊有關物質單個雜質限度明顯偏高，建議調整頭孢拉定膠囊中4′，5′-雙氫頭孢拉定峰面積、其他單個雜質峰面積（除頭孢氨芐和4′，5′-雙氫頭孢拉定）及雜質總峰面積（除頭孢氨芐）等規定。

周冉等[4]比較了國家食品藥品監督管理總局(CFDA)發布的注射用鹽酸頭孢替安標準及鹽酸頭孢替安碳酸鈉混合粉標準下色譜系統的適應性，結果采用磷酸鹽緩沖體系測定鹽酸頭孢替安有關物質，各雜質與主峰間的分離效果更好。

鐘瑩等[5]測定了注射用頭孢地嗪鈉的有關物質，建立的梯度洗脫法具有更強的雜質分析能力，樣品中各成分的分離度及檢出靈敏度均滿足有關物質限度的測定要求，可有效評價產品的質量。

郭艷娟等[6]采用梯度洗脫方法對國內10個廠家生產的注射用頭孢唑肟鈉樣品進行了有關物質檢查，此方法靈敏度較高、分離效能較好，檢出雜質的個數和總量均較現行法定標準多。

施潔明[7]建立了測定注射用硫酸頭孢匹羅中有關物質的梯度洗脫方法，該方法中頭孢匹羅與頭孢噻肟酸（CME-I）、7-ACA、2-巰基苯并噻唑（2-MBT）和2，3-CYCPP間分離完全。

由表4可見，揉捻壓力、次數、時間3個因素均影響卷曲形茶做形效果，其中，揉捻壓力的影響最大，次數和時間的影響較小。由于3個因素的F值和P值均未達顯著水平，說明，3者對總體品質的影響都不顯著。

張姮婕等[8]測定了注射用頭孢他啶中的有關物質，采用梯度洗脫方法可從樣品中分離出21個雜質，且各雜質間具有良好的分離度。

彭力等[9]建立了美洛西林鈉有關物質測定方法，采用梯度洗脫方式，主峰與所有有關物質峰均達到基線分離，且分離度較好。

陳希等[10]采用2010年版《中國藥典（二部）》中青霉素Ⅴ有關物質的測定方法，考察了青霉素V鉀片及膠囊中水分含量與有關物質間的相關性，結果水分和有關物質呈正相關。

陳汝紅[11]系統地對芐星青霉素中有關物質測定條件進行了考察，最終確立的方法專屬、靈敏；與歐洲藥典所載樣品溶解方法及色譜條件相比，克服了諸多不足。

任鳳英等[12]對頭孢他美鈉有關物質測定條件進行了系統考察，最終確立的色譜條件專屬性強，有關物質與主峰間均能完全基線分離。

阮丹等[13]分別測定了鹽酸頭孢甲肟原料藥及注射用鹽酸頭孢甲肟有關物質，建立的梯度洗脫方法可檢出更多主峰后的雜質，且主峰及各雜質峰間分離度良好。

上官丹罡等[14]綜述了頭孢哌酮鈉及其復方制劑在合成、貯存及使用過程中可能產生的有關物質，并介紹了已知化學結構的有關物質。頭孢哌酮鈉及其復方制劑有關物質常用分析方法為反相高效液相色譜法，其他分析方法有分子排阻色譜法、膠束電動毛細管色譜法(MEKC)等。

2 大環內酯類

目前，臨床應用的大環內酯類抗生素中，阿奇霉素、羅紅霉素和紅霉素等第1代，第2代大環內酯類應用非常廣泛，但隨著多種耐藥菌的出現，第3代大環內酯類抗生素也逐漸投入臨床。大環內酯類抗生素的有關物質按來源可分為工藝雜質類和降解雜質類。黃珊等[15]就大環內酯類藥物雜質來源、分類及雜質譜的建立進行了詳細綜述。

張斗勝等[17]采用2010年版《中國藥典（二部）》阿奇霉素原料有關物質檢查法，考察了國產阿奇霉素顆粒中常用的20種輔料對現行阿奇霉素雜質HPLC法分析的干擾作用。結果表明，國產阿奇霉素顆粒劑處方中添加的輔料不影響測定。

柏大為等[18]建立了注射用阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉有關物質的測定方法，該方法較國家部頒標準具有簡便、準確、專屬性強等優點，有關物質峰（降解產物峰）與主成分峰均達到基線分離，可用于阿奇霉素有關物質的檢測。

曾紅霞等[19]通過強力破壞試驗及質譜檢測，確定了羅紅霉素顆粒和干混懸劑中的降解產物為去紅霉糖羅紅霉素，并建立了去紅霉糖羅紅霉素的檢測方法，可為羅紅霉素顆粒和干混懸劑有關物質的檢查提供參考。

3 氨基苷類

氨基苷類抗生素分子結構中無發色團，無法采用紫外線吸收(UV)法檢測，目前有關物質的檢測方法多采用柱前或柱后衍生化方法、蒸發光檢測器（ELSD）及脈沖安培電化學檢測器（PAD），流動相的選擇多采用可揮發性鹽三氟乙酸（TFA）系統。

秦峰等[20]建立了 PAD檢測法測定慶大霉素的 C組分及其有關物質的分析方法，同時平行采用 2014版英國藥典（BP）的電化學方法測定有關物質含量，結果2種方法的測定結果基本一致。

王琰等[21]建立了鹽酸大觀霉素含量及有關物質PAD測定方法，該方法采用較有優勢的TFA作為流動相、四電位的工作模式進行電化學檢測，并進行了全面的方法學考察，各主要雜質色譜峰間的分離度均符合規定。

劉英等[22]比較了2010年版《中國藥典》和2014版英國藥典（BP）中收載的2種測定硫酸慶大霉素中的組分及其有關物質方法，結果2010年版《中國藥典》所載ELSD法能更有效地分離西索米星及其相鄰雜質，同時雜質峰的檢出個數和靈敏度均較英國藥典PAD法有所增加。

張鳳妹等[23]采用UV末端吸收（200 nm）法測定硫酸阿米卡星及注射液的有關物質，雜質成分除卡那霉素（雜質D）外均無法檢出，需采用薄層色譜(TLC)法另行控制，其余各成分的分離情況良好。

孫晶等[24]采用柱前衍生化對依替米星有關物質進行檢查，并運用LC-TOF／MS和LC-MS／MS鑒定主要有關物質，方法的專屬性、靈敏度和準確度均較高，衍生化產率更高、產物更穩定。通過結構鑒定將依替米星有關物質分為依替米星同系物、糖苷鍵斷裂的降解產物、具有C=C雙鍵的有關物質、氨基被羥基取代的有關物質4類。

朱曉 等[25]采用PAD檢測法對硫酸依替米星氯化鈉注射液中有關物質進行測定，所建立的方法能使主成分依替米星與中間體及主要雜質之間有效分離，但仍有部分雜質及依替米星與后相鄰峰之間不能達到基線分離。同時，建立了ELSD法測定硫酸依替米星氯化鈉注射液有關物質的方法，改善了因樣品稀釋溶劑造成的峰形裂分[26]。對比PAD法測定結果，2種方法測得的單個最大雜質結果比較接近，但PAD法測得的雜質個數及總量均比ELSD法要高。

4 其他

HPLC法在四環素類、林可酰胺類抗生素及抗腫瘤抗生素有關物質的檢查中均為常用測定方法。土霉素的有關物質采用主要雜質對照品定位來控制，顧云等[27]建立土霉素二水物有關物質的測定方法，結果雜質峰之間、雜質與主峰之間均能分離良好，方法專屬性較好。

黃萍等[28]采用HPLC法對四環素片中四環素及異構體進行分析，結果四環素、4-差向四環素、土霉素、脫水差向四環素和脫水四環素5種組分的分離均符合規定。

張菁等[29]測定了鹽酸林可霉素滴眼液有關物質，建立的方法專屬性較好，林可霉素與相鄰雜質之間分離度良好，防腐劑峰并不干擾有關物質的測定。

王建等[30]建立了測定鹽酸克林霉素棕櫚酸酯原料藥、分散片、顆粒及干混懸劑有關物質的方法，采用UV法進行檢測較示差折光法檢測可檢出更多主峰后的雜質，且克林霉素棕櫚酸酯與10種合成中間體、副產物完全分離。

梁鍵謀等[31]測定了克林霉素磷酸酯及其注射劑的有關物質，所建立的方法較國家標準（YBH09502003）方法，對克林霉素磷酸酯各相關雜質的檢出與分離明顯更有效。

魯瑞娟等[32]測定了鹽酸博來霉素組分博來霉素A2和博來霉素B2的含量，且A2及B2分別與相鄰雜質峰的分離符合規定。

5 結語

抗生素質量分析主要有色譜法、化學發光法、熒光法、近紅外光譜法及電化學法等。目前，HPLC法作為抗生素質量分析最常用的手段，如ELSD、電化學檢測器（ECD）等新檢測器及新型色譜柱填料的應用，為抗生素的質量控制提供了更準確的分析方法。抗生素因其所含雜質種類與雜質含量均比普通合成化學藥物復雜，對于抗生素雜質的控制，一般包括每個明確的已知雜質、每個明確的未知特定雜質、任何非特定雜質（不超過鑒定限度）及總雜質。近年來，色譜聯用技術尤其HPLC-MS技術在抗生素雜質鑒定方面應用逐漸增多，MS技術對于母核結構基本已知的化合物的結構推測較準確，可為雜質歸屬為母體化合物或某側鏈等有關物質提供充分證據。

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R927.1；R978.1

A

1006－4931(2015)23－0255－03

劉拴娣，女，副主任藥師，研究方向為藥學，（電子信箱）269816429＠qq.com。

2015－08－13)