血小板活化因子乙酰水解酶基因多態性V279F與缺血性卒中易感性及復發的相關性研究

馬永盛，潘旭東

人類血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）乙酰水解酶（acetylhydrolase，AH）是一種非鈣離子依賴性水解酶，主要由巨噬細胞和成熟的淋巴細胞所分泌，在低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholestreol，LDL-C）表面水解氧化型磷脂，產生氧化型脂肪酸和溶血卵磷脂，因后兩者可導致炎癥相關黏附分子和細胞因子的表達，下調一氧化氮表達，升高氧化應激并導致血管內皮細胞凋亡，從而具有促動脈粥樣硬化作用[1-2]。

人類PAF-AH被PLA2G7基因編碼，該基因位于6號染色體6p21-p12，目前發現PAF-AH基因與心腦血管病發病相關，其中位于9號外顯子的V279F基因多態性位點（rs16874954），已經發現與日本人冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血性卒中及頸動脈粥樣硬化等疾病相關[3]。但是在韓國展開的類似研究卻得出了相反的結論[4]。到目前為止V279F基因多態性位點與中國漢族人群缺血性腦血管病的發病及預后研究較少。本研究對PLA2G7基因多態性V279F與低分子肝素試驗病因分型（the Trial of Org10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）亞型及缺血卒中復發的關系做一探討，以明確PAF-AH基因多態性與缺血性卒中發病及復發的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究觀察缺血性卒中患者及對照組相關危險因素及基因型分布為回顧性病例對照研究，隨訪分析卒中患者復發的影響因素為前瞻性研究，連續選取2008年11月～2014年11月山東省濰坊市人民醫院神經內科住院的首發急性TOAST分型[5]中大動脈粥樣硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）性卒中和小動脈閉塞（small-artery occlusion，SAO）性卒中患者共386例為試驗組。對照組為我院同期既往無卒中及其他神經系統疾病證據的健康體檢者386例。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 入組標準 年齡36～90歲；發病＜72 h，診斷符合第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準[6]；為首次發??；全部患者均經顱腦計算機斷層掃描（computed tomography，CT）和（或）磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查證實；符合TOAST分型[5]中的LAA性卒中和SAO性卒中。

1.3 排除標準 短暫性腦缺血發作，中樞神經系統腫瘤，腦血管畸形，自身免疫病，嚴重心臟疾病及近期發生心肌梗死、心絞痛、近期輸血、服用抗凝、抗血小板藥物者，TOAST分型[5]中的心源性卒中、不明原因性卒中、其他原因所致卒中。

1.4 方法

1.4.1 危險因素評估 記錄所有研究對象的臨床資料，包括身高、體重、既往史、家族史、血壓、血糖、血脂等，并計算體重指數（body mass index，BMI），BMI=體重（kg）/身高（m）2[7]。所有研究對象均完成顱腦MRI或CT檢查明確顱內病變，并行頸部血管超聲，經顱多普勒、顱腦磁共振血管成像/計算機斷層掃描血管成像/數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）檢查明確腦血管情況，完成心臟超聲和心電圖檢查明確心臟病變情況。

危險因素評估標準：冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。哼\動或其他增加心肌需氧量時出現胸痛發作，休息或含服硝酸甘油后疼痛迅速消失，癥狀持續1個月以上[8]；吸煙：確診時患者吸煙平均≥每天10支，并超過5年或已戒煙但未超過5年[9]；飲酒：每日酒精攝入量≥24 g/d[10]；糖尿病：空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或任意時刻血糖≥11.1 mmol/L，并有典型糖尿病癥狀[11]；高血壓：收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg[12]；高脂血癥：血清總膽固醇水平超過5.72 mmol/L，血清甘油三酯水平超過1.7 mmol/L，或目前應用降脂藥物治療[13]。

1.4.2 血液的采集 所有研究對象均于清晨空腹抽取前臂靜脈血（病例組于入院后次日凌晨采血）6 ml。3 ml血置于普通生化試管，室溫固定2 h，離心（3000 r/min）10 min，收集上清液于Eppendof管中，－80℃凍存待測。3 ml置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管，室溫固定2 h，常溫下2700 r/min離心10 min，收集白細胞層置于Eppendof管中，－80℃保存待測，留取作提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）用，集中做多態性分析。

圖1 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

1.4.3 PAF-AH濃度測定 采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血漿PAF-AH濃度，試劑盒應用美國R&D公司PAF-AH定量測定試劑盒，操作步驟嚴格按說明書進行。

1.4.4 外周全血基因組DNA提取 應用血液基因組DNA提取試劑盒（非離心柱型）提取白細胞DNA（上海生工生物工程有限公司），操作步驟嚴格按說明書進行。

1.4.5 PAF-AH基因多態性V279F分析

1.4.5.1 PCR擴增 應用聚合酶鏈式反應法進行基因擴增，分光光度法對DNA擴增產物進行純度測定，DNA樣本保存于－20℃冰箱。PCR所用引物均由上海生物技術工程有限公司設計并核查，V279F引物序列：上游引物為5′TCTTATTTTCTTACCTGAATCTCTGA 3′，下游引物為5′CATCCCCATGAAATGAA CAAT3′。使用美國ABI公司生產PCR反應儀擴增目的基因片段。PCR總反應體系50 μl：DNA模板1 μl（10～50 μg/L），預混DNA聚合酶（PremixExTaq）0.5 μl，上下游引物各1 μl（10 μmol/L），三磷酸脫氧核（糖核）苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μl，氯化鎂（MgCl2）5 μl，加雙蒸水至50 μl。P CR條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，退火35 s，72℃延伸40 s，72℃修復延伸5～8 min，共35個循環。PCR反應結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳150 V、100 mA 20 min電泳觀察，PCR擴增產物大小約221 bp（圖1）。

1.4.5.2 PAF-AH基因V279F多態性分析 由上海生物工程技術有限公司采用基因直接測序法確定V279F多態性位點的單核苷酸多態性，PAF-AH基因V279F位點存在VV、VF、FF 3種基因型（圖2）：VV為野生型，VF為突變雜合子，FF為突變純合子。

圖2 PAF-AH基因V279F多態性位點單向測序圖

1.4.6 隨訪 為評價基因多態性與缺血性卒中復發的相關性，本研究僅對試驗組患者隨訪4.5年（范圍0.1～6年）。終點事件為復發急性缺血性卒中，為首次卒中后，原有癥狀痊愈或有好轉后再次出現新的中樞神經系統損害的定位體征或原有癥狀加重，頭部CT或MRI證實有新的一致性病灶或原有病灶擴大，診斷標準符合第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準[5]。隨訪由內科學研究人員通過標準提問和電話隨訪，對出現卒中復發癥狀者進一步行顱腦影像學檢查確診復發。其中23例患者因為移民失訪。最終363例缺血性卒中患者完成，包含235例男性和128例女性，隨訪率為94.0%。

1.5 統計學方法 所有統計分析使用SPSS 17.0統計軟件進行。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析；計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型和等位基因頻率的組間區別分析采用卡方檢驗。對兩組的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg分析。通過計算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）表示相對危險度，通過Logistic回歸分析缺血性卒中危險因素、PAF-AH基因多態性與缺血性卒中的關系，多元生存分析缺血性卒中患者預后與不同基因型的關系。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 基線資料 兩組患者在年齡、性別、體重指數方面比較差異無顯著性。試驗組在高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙方面較對照組差異具有顯著性。試驗組血清PAF-AH水平明顯高于對照組，差異具有顯著性（P＜0.01）（表1）。

2.2 V279F多態性與缺血性卒中及其亞型的相關性 V279F多態性的基因型和等位基因頻率在試驗組和對照組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性（試驗組c2=2.564，P=0.124，對照組c2=0.058，P=0.813），無選擇偏倚。試驗組各亞組經Hardy-Weinberg平衡檢驗均達到遺傳平衡。由于FF基因型例數較少，將其并入VF基因型與VV基因型進行比較。顯性模型VF+FF基因型在試驗組表達頻率明顯高于對照組，差異具有顯著性（OR 1.47，95%CI 1.07～2.02，P=0.02）。V279F中的VF基因型在試驗組表現率較高（28.8%，OR 1.43，95%CI 1.03～1.98，P=0.03）。而V279F中的F等位基因頻率在試驗組明顯高于對照組（OR 1.42，95%CI 1.07～1.89，P=0.02）。使用Logistic回歸對高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高脂血癥、吸煙、飲酒因素進行校正后，V279F中的VF+FF基因型及F等位基因與缺血性卒中仍顯著相關（兩者分別為OR 1.43，95%CI 1.02～2.00，P=0.042；OR 1.42，95%CI 1.01～2.00，P=0.042）（表2）。

據TOAST分型標準分型后，VF+FF基因型及VF基因型與LAA性卒中顯著相關，對血管危險因素進行校正后該關聯性依然存在（兩者分別為OR 1.73，95%CI 1.18～2.55，P＜0.01；OR 1.67，95%CI 1.13～2.48，P=0.012）。而SAO性卒中與各基因型及等位基因頻率無顯著相關性（P＞0.05）（表2）。

表1 兩組臨床基本資料特征比較

表2 V279F基因型和等位基因分布

2.3 V279F各基因型與缺血性卒中復發的關系 363例缺血性卒中患者完成隨訪，隨訪率94%，多元回歸分析顯示失訪患者與隨訪患者基本臨床數據相似，包括血管危險因素、既往病史、治療及基因型分布等（表1）。Cox回歸分析顯示V279F基因型與缺血性卒中患者復發相關。其中VF+FF基因型與缺血性卒中復發相關性強（HR 1.75，95%CI 1.03～2.29，P=0.041）。缺血性卒中各亞型復發率與V279F基因型分析顯示，LAA性卒中與VF+FF基因型相關（HR 1.84，95%CI 1.13～2.41，P=0.037），而SAO性卒中復發與各基因型無顯著相關性（表3）。

表3 各基因型Cox回歸生存分析

3 討論

1996年，Stafforini等[14]發現日本人中PAF-AH基因V279F的一個活性部位的缺失性突變導致PAF-AH催化活性下降，此后在不同種族人群中開展了許多關于PLA2G7基因V279F是否與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病相關的研究。Li等[15]發現在中國漢族人群中，V279F與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發病相關，且等位基因F升高與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病密切相關，這與Yamada等[16]在日本人群中的發現一致。然而，在韓國的Jang等[14]發現V279F升高確導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發病率下降。因冠狀動脈粥樣硬化性心臟病與缺血性卒中具有相似的發病危險因素及發病機制，研究發現V279F與缺血性卒中相關，Hiramoto等[17]對日本人群住院缺血性卒中患者進行研究，先后收集120例缺血性卒中患者及134例無卒中者作為對照，對兩組人群抽取血液樣本進行PCR試驗，分析V279F位點各基因型及等位基因在兩組人群中的差異，發現FF+VF基因型和F等位基因頻率與缺血性卒中有關。本研究中，V279F基因位點的FF+VF基因型，VF基因型和F等位基因頻率均與濰坊地區漢族人群缺血性卒中的發病相關，在對卒中相關危險因素進行校正后，該相關性依然存在，與Hiramoto等研究結論一致。而Liu等[18]對中國東北地區的漢族人群缺血性卒中與PLA2G7基因多態性進行病例對照研究，入組卒中患者非急性卒中，發現V279F基因多態性與中國漢族人群缺血性卒中發病無關。對于這種不同，基因遺傳性可能是重要的因素，而本研究對照組中V279F基因型頻率（72%VV，26%VF和2%FF）均與Liu等所研究中國東北地區人群不同（88%VV，11%VF和1%FF）。

對PLA2G7基因V279F與缺血性卒中的相關性可作如下解釋：數項研究報道PAF-AH活性與缺血性卒中相關。鹿特丹前瞻性研究發現PAF-AH水平與缺血性的發病密切相關[19]。Bruneck研究也發現PAF-AH活性與缺血性卒中相關[20]。一篇meta分析對PAF-AH與缺血性卒中的關系進行了總結[21]，在校正了傳統危險因素后，PAF-AH相關危險因子與缺血性卒中密切相關。

對V279F基因位點與缺血性卒中不同分型的關系，本研究發現，V279F基因位點與LAA性卒中存在顯著相關性，而與SAO性卒中無顯著相關性，可能是由于PAF-AH基因與動脈粥樣硬化相關。溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine-PC）是PAF-AH最重要的代謝產物，它在炎性細胞因子的生成及黏附分子的誘發過程中起重要作用，對巨噬細胞起到趨化因子的作用，并導致血管平滑肌增生。且溶血卵磷脂可對PAF-AH的生物活性進行修飾，導致惡性循環進而促使炎性介質大量生產，從而促進動脈硬化過程。PAF-AH的另外一種代謝產物氧化型脂肪酸，可以通過提高氧化應激水平，在血漿中及血管壁中生成氧化型低密度脂蛋白及其他脂蛋白從而促進動脈硬化過程[22]。

對于PAH-AF基因多態性位點與動脈硬化性疾病復發的關系，Maiolino等[23]研究發現PAF-AH基因多態性位點rs1805017與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者發生急性心肌梗死等心血管事件相關。Tsai等[24]發現中國臺灣地區人群中血漿PAF-AH水平與急性缺血性卒中復發相關，本研究發現V279F位點與缺血性卒中復發相關，與LAA性卒中關系更為密切，為缺血性卒中復發獨立的預測因素。

總之，本研究發現，PAF-AH基因中V279F多態性位點可能與缺血性卒中的發病有關，該關聯性不依賴于其他常見卒中危險因素，可作為卒中易感性基因預測標記，對卒中的復發提供獨立的新的預測基因因素，對卒中的預防和治療提供新的基因靶點。然而，該研究有許多局限性，如樣本量偏少，病例來源范圍小等。因此，更大樣本量的在不同種族人群中的關于PLA2G7基因多態性與缺血性卒中研究可能會有更多的發現。

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【點睛】本研究分析發現血小板活化因子乙酰水解酶基因多態性V279F與缺血性卒中易感性及復發相關。