脊柱結(jié)核基因診斷進展

脊柱結(jié)核基因診斷進展

鐘志偉，黃艷，彭艷，武漢*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長春130033)

隨著HIV肆虐及免疫缺陷病患者的增加，全球結(jié)核發(fā)病有明顯上升趨勢，中國是全球22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一[1]， 結(jié)核患者數(shù)居世界第2位，脊柱結(jié)核作為常見的繼發(fā)性肺外結(jié)核發(fā)病率也明顯增加。目前脊柱結(jié)核的診斷主要是根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像特征、實驗室檢查及診斷性治療情況進行綜合診斷[2]，現(xiàn)行的實驗室診斷和耐藥性檢測及菌種鑒定方法遠不能滿足脊柱結(jié)核早期診治的需求，迫切需要加強新技術(shù)的研究和應(yīng)用。近年來，基因診斷作為疾病診斷的研究熱點正逐步應(yīng)用于臨床，其對疾病診斷價值已得到廣泛認同，本文將主要從常用脊柱結(jié)核基因診斷技術(shù)、基因診斷的優(yōu)缺點及相關(guān)研究進展方面作一綜述。

基因診斷又稱DNA診斷，它是利用重組DNA技術(shù)，直接從基因水平檢測致病微生物的存在和種類，從而對臨床疾病作出診斷。1972年Goff SP和Berg P首次成功重組了世界上第一批DNA分子，標(biāo)志著基因檢測技術(shù)的誕生[3]。20世紀(jì)70年代中后期，由于PCR、基因芯片等技術(shù)的出現(xiàn)基因檢測得到了快速發(fā)展[4]。從病原學(xué)角度，基因診斷可應(yīng)用于各種病毒、細菌和寄生蟲病的檢測，隨著結(jié)核分枝桿菌全基因組測序工作的完成，結(jié)核疾病的診斷也進入了基因時代，基因診斷技術(shù)在脊柱結(jié)核診斷領(lǐng)域的應(yīng)用已越來越被人們所認識，它在病原體檢測、藥物選擇和療效評價等方面具有重要作用，必將為脊柱結(jié)核的防控和診治作出重大貢獻。

1常用脊柱結(jié)核基因診斷技術(shù)

脊柱結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌全身感染的局部表現(xiàn)，約占骨關(guān)節(jié)結(jié)核50%，好發(fā)于兒童和青少年[5]。以腰椎最為多見，胸椎次之，胸腰段占第三位，頸椎和骶椎較少見。其中，椎體結(jié)核約占99%、椎弓結(jié)核占1%左右。受累的脊柱表現(xiàn)有骨質(zhì)破壞及壞死，有干酪樣改變和膿腫形成，椎體因病變和承重而發(fā)生塌陷，嚴(yán)重者可造成癱瘓[6]。由于脊柱結(jié)核患者早期典型臨床特征不明顯，很容易造成誤診或者漏診，目前脊柱結(jié)核診斷仍以臨床癥狀結(jié)合X線、CT、MRI表現(xiàn)為主要診斷手段，尚缺乏敏感度高、特異性強的早期診斷指標(biāo)[7]。應(yīng)用基因診斷技術(shù)對脊柱結(jié)核的早期發(fā)現(xiàn)、脊柱結(jié)核患者的耐藥監(jiān)測、療效判斷等都具有較大的臨床使用價值和意義。目前常用的脊柱結(jié)核基因檢測技術(shù)主要有聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction， PCR)、基因芯片、核酸雜交等。

1.1　聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是指在體外由引物介導(dǎo)的DNA序列酶促合成反應(yīng)，即體外DNA擴增技術(shù)，包括變性、退火及延伸等幾步反應(yīng)，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷[8]。Hance等[9]最先把PCR技術(shù)應(yīng)用到結(jié)核桿菌的診斷，擴增出一383bp序列，編碼65kD分枝桿菌抗原，再用探針雜交，敏感度達到樣品細菌數(shù)少于100個即可被檢出的水平。對于骨關(guān)節(jié)結(jié)核基因診斷的報道始于1994年Lombard EH等[10]利用基因診斷技術(shù)檢測24名疑似骨結(jié)核病患者的骨髓液，其陽性率達到42%，明顯高于涂片抗酸染色法。隨后Sun Y等[11]也應(yīng)用PCR技術(shù)檢測60名骨結(jié)核病人骨髓液，陽性率為83%，發(fā)現(xiàn)基因檢測技術(shù)對診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核具有重要應(yīng)用價值。作為簡單有效的診斷方法，PCR技術(shù)在脊柱結(jié)核的診斷中已發(fā)揮了顯著作用。Li等[12]采用熒光定量PCR技術(shù)及抗酸染色法對208例結(jié)核病患者痰液中結(jié)核分枝桿菌進行檢測，結(jié)果顯示兩種方法檢出陽性率分別為51.92%和25.96%， PCR法檢出的陽性率明顯高于抗酸染色法檢出的陽性率。同樣Portillo-Gomez等[13]運用不同方法檢測286例肺外結(jié)核病人腦脊液、胸膜液及腹水中結(jié)核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)的特異性、敏感性最高。Bahram等[14]發(fā)現(xiàn)，通過多重實時定量PCR對不同管家基因的測定，可以快速準(zhǔn)確地鑒別結(jié)核分枝桿菌屬和非結(jié)核分枝桿菌屬，對臨床脊柱結(jié)核疾病診斷具有重要作用。此外，研究表明，MCP-1-2518 位點GG 基因型和G 等位基因均可能與脊柱結(jié)核的易感性相關(guān)，通過PCR技術(shù)檢測人群基因組DNA中MCP-1-2518 位點的G、A 等位基因的分布頻率[15]，可以預(yù)測患者罹患脊柱結(jié)核的風(fēng)險，從而對易感人群進行預(yù)防性保護。

1.2　基因芯片

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因診斷在脊柱結(jié)核診斷中作用日益明顯，而基因芯片技術(shù)的發(fā)展成為脊柱結(jié)核耐藥基因診斷的一個新里程碑，基因芯片是通過微陣列技術(shù)將大量的DNA片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息[16]，是伴隨“人類基因組計劃”的研究進展而快速發(fā)展起來的一門高新技術(shù)。Zhang等[17]最先將基因芯片用于脊柱結(jié)核診斷，研究表明在對153名脊柱結(jié)核患者利福平及異煙肼耐藥檢測中，CapitalBio? 基因芯片靈敏度達到93.55%?，檢測過程平均用時僅5.8小時，具有高通量檢測、靈敏準(zhǔn)確、高效快速等優(yōu)點。隨著結(jié)核病疫情不斷惡化，脊柱結(jié)核發(fā)病率及復(fù)發(fā)率亦逐年增加，耐藥結(jié)核、耐多藥結(jié)核甚至廣泛耐藥結(jié)核的流行是主要原因之一[18]。通過基因芯片技術(shù)診斷耐藥脊柱結(jié)核，可有效控制患者復(fù)發(fā)率。近年生物技術(shù)不斷發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因及相關(guān)位點突變不斷被分析鑒定[19]，通過對相關(guān)耐藥基因設(shè)計芯片進行檢測，即可判斷脊柱結(jié)核患者耐藥情況，為患者選擇有效藥物治療方案提供依據(jù)，也是治愈結(jié)核病、控制結(jié)核病流行的前提[20]。例如利福平耐藥相關(guān)基因主要為rpoB[21]，Gingeras等[22]利用rpoB基因保守區(qū)705bp的核苷酸探針，對44株結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥分離株進行檢測，發(fā)現(xiàn)了40株存在rpoB基因的突變，突變檢出率為90.9%，表明基因芯片用于結(jié)核耐藥檢測的敏感性、特異性均較高，且檢測結(jié)果與基因測序完全一致[23]，為后期患者進一步治療提供參考。近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究已初步證實，基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥檢測具有高度的準(zhǔn)確性[24]，而且基因芯片耐藥檢測是基于DNA片段的檢測，安全性高，開展性廣。

1.3　核酸雜交

核酸雜交是指用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知核酸序列(形成異源雙螺旋)，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置或大小顯示出來。結(jié)核分枝桿菌基因組中含有特異的高度重復(fù)序列，將這些重復(fù)序列作為靶基因，用核酸雜交和PCR等技術(shù)對脊柱結(jié)核患者進行特異性檢測就可達到基因診斷的目的[25]。目前主要核酸雜交技術(shù)包括膜上印跡雜交、斑點雜交、原位雜交。這些方法在臨床診斷中都已得到應(yīng)用，與脊柱結(jié)核的疾病診斷也密切相關(guān)[26]。LIANG等[27]采用反向斑點雜交技術(shù)分析鑒定37例脊柱結(jié)核術(shù)后患者病理組織或膿液抗酸染色陽性標(biāo)本的分枝桿菌菌種，結(jié)果表明與傳統(tǒng)診斷方法相比，核酸雜交技術(shù)可快速高效準(zhǔn)確地鑒定脊柱結(jié)核分枝桿菌菌種，降低誤診漏診率，同時為脊柱結(jié)核患者有效治療爭取了時間。核酸雜交技術(shù)簡便、快速、靈敏，CHEN等[28]研究發(fā)現(xiàn)膜反向斑點雜交技術(shù)可以直接檢測結(jié)核分枝桿菌katG、rpoB 基因突變，為臨床檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性提供輔助診斷手段，同時也為該技術(shù)的進一步推廣，應(yīng)用于其它的病原微生物及基因突變檢測領(lǐng)域奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

目前的研究[29]表明，與傳統(tǒng)藥物敏感性檢測方法相比，核酸雜交技術(shù)可在臨床結(jié)核桿菌快速耐藥檢測中一次性對多種耐藥基因的多種基因位點進行快速基因型鑒定，具有檢測信息量大的特點，臨床應(yīng)用前景極大[30]。

2基因診斷的優(yōu)缺點及展望

2000年人類基因組草圖的公布，標(biāo)志著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展已進入“基因組醫(yī)學(xué)”時代[31]。基因診斷技術(shù)雖然僅短短20多年歷史，但發(fā)展迅速，在臨床診治中得到廣泛應(yīng)用。目前對于脊柱結(jié)核的實驗室診斷主要依據(jù)細菌學(xué)檢查，雖然細菌學(xué)檢查是結(jié)核病確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)周期長、繁瑣費時、影響因素多，不能作為快速診斷方法。與之相比，基因診斷具有很突出的優(yōu)點，主要包括：第一特異性高，通過選用特異性高的分子探針作為工具，可有針對性的檢測樣本特異表達基因的差異情況。第二靈敏度高，通過PCR技術(shù)，將檢測的信號不斷放大，即使是微量的樣品也能得出精確的結(jié)果。第三穩(wěn)定性和重復(fù)性好。第四，早期快速診斷性，只要外源基因進入或者基因發(fā)生變化，不管處于何種時期，都可以有效診斷，而且用時短，操作方便[32]。基因診斷的臨床價值是值得肯定的，但近年來的臨床實踐也證明其仍具有一定的局限性。首先針對PCR技術(shù)缺點主要表現(xiàn)在假陽性[33]。PCR的敏感性極高,微量的污染即可導(dǎo)致假陽性的發(fā)生，這是PCR技術(shù)假陽性發(fā)生的最主要原因。所以在標(biāo)本收集至整個操作過程中的各個環(huán)節(jié)必須保證嚴(yán)格的“無菌操作”，以避免污染；同時提高引物特異性也是避免假陽性發(fā)生的關(guān)鍵。而基因芯片雖然在結(jié)核耐藥診斷研究中意義重大，但由于目前基因芯片技術(shù)尚不夠完善，還在不斷發(fā)展，特別是其價格昂貴、對操作的要求較高、重復(fù)性差等使其應(yīng)用范圍受到很大限制，這些問題主要需從樣品的制備、探針合成固定、分子的標(biāo)記等方面著手解決。

脊柱結(jié)核早期診斷可以有效預(yù)防患者并發(fā)癥的出現(xiàn)，對于我國來說，面對結(jié)核病死灰復(fù)燃、脊柱結(jié)核病例逐年攀升的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，對脊柱結(jié)核病的預(yù)防和早期診斷是一項非常值得探討的重大課題。基因診斷作為新興疾病診斷技術(shù)，近年來取得了重大進展，包括PCR、基因芯片以及核酸雜交等技術(shù)比傳統(tǒng)方法更特異、敏感、快速，對臨床鑒定及流行病學(xué)研究都產(chǎn)生了深遠的影響。但是，由于技術(shù)上的難點和高昂的成本，基因診斷還存在著諸多缺點有待進一步解決和提高。客觀地講,限于目前的技術(shù)水平,基因診斷方法還不能完全替代常規(guī)診斷手段,它只是作為常規(guī)診斷的輔助方法。但隨著基因組計劃的深入開展和科技的不斷發(fā)展，基因診斷技術(shù)將會更加完善并在臨床上逐步得到普及。

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收稿日期：(2014-08-18)

作者簡介：鐘志偉(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：脊柱外科；武漢(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師。

文章編號：1007-4287(2015)01-0165-04

通訊作者*

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：30772209)