奶水牛子宮內膜炎病原菌鑒定與藥敏試驗

方麗婷 李俊 吳偉虎（廣西-東盟經濟技術開發區（南寧華僑投資區）動物衛生監督所 530105）

奶水牛子宮內膜炎病原菌鑒定與藥敏試驗

方麗婷 李俊 吳偉虎（廣西-東盟經濟技術開發區（南寧華僑投資區）動物衛生監督所 530105）

通過對南寧的某奶水牛場中的12頭患子宮內膜炎奶水牛進行子宮采樣和調查，并在無菌條件下，對采集的樣本進行了病原菌的分離鑒定和藥物敏感性試驗。分離純化培養得到38種細菌，沒有發現真菌。藥物敏感性試驗結果表明，葡萄球菌對紅霉素、克林霉素、米諾環素、諾氟沙星、頭孢吡肟高度敏感，對復方新諾明、氨曲南等產生了不同程度的耐藥性；奈瑟氏菌對克拉霉素、頭孢吡肟高度敏感，對復方新諾明、氨曲南產生了不同程度的耐藥性；非發酵菌和腸桿菌科對頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南等有較高的敏感性，對氨芐西林、哌啦西林、氧氟沙星、鏈霉素等產生了不同程度的耐藥性。

奶水牛；子宮內膜炎；病原菌；分離鑒定；藥敏試驗

1 試驗目的

由于近年來，人們不合理地使用抗生素類藥物，導致具有耐藥性菌株越來越多，藥物殘留也越來越嚴重，造成不同地區和不同環境引起子宮內膜炎的致病菌都有所不同，使得奶水牛子宮內膜炎的治療難度越來越大，要求也越來越高。而且奶水牛子宮內膜炎的發病依然比較高，給奶水牛養殖業帶來相當嚴重的經濟損失。

因此，本試驗通過對南寧某奶水牛場中的患子宮內膜炎奶水牛進行了子宮采樣和調查，并在無菌條件下，對采集的樣本進行了病原菌的分離鑒定，并進行藥物敏感性試驗，耐藥性分析。為了更好地了解當地的子宮內膜炎的病原菌的細菌種群，篩選出抑菌效果明顯的藥物，為臨床治療奶水牛子宮內膜炎及用藥提供理論依據。

2 試驗材料

2.1 試驗樣品來源

本試驗樣品是按照臨床型奶水牛子宮內膜炎的診斷標準選取南寧附近某牛場的12頭患病奶水牛。清洗病牛陰部，用直腸檢查的方法用手握住子宮頸，使子宮內黏液流出陰道。棄去最初流出黏液，用已經消毒好的青霉素瓶收集中間或最后流出的黏液，密封，做好標記，迅速帶回實驗室做細菌的培養分離鑒定[1]。

2.2 主要培養基及制備

2.2.1 營養肉湯（北京陸橋）

準確稱取成品李氏菌增菌肉湯2.2g，放入燒杯中，加入100ml蒸餾水，加熱溶解，分裝試管5ml每管，高壓滅菌l5min，待冷卻后4℃保存備用。

2.2.2 營養瓊脂02.2.5（北京奧博星）

準確稱取成品營養瓊脂3.3g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱煮沸至溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固，4℃保存備用。

2.2.3 Fungi Medium真菌培養基CM802（北京陸橋）

準確稱取成品Fungi Medium真菌培養基2.85g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后4℃保存備用。

2.2.4 MH血瓊脂基礎CM177（北京陸橋）

準確稱取成品MH血瓊脂基礎3.8g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷至50℃，每瓶加入10ml新鮮無菌家兔血，倒制成平板，制成9%血液瓊脂培養基，待凝固，4℃保存備用。

2.2.5 麥康凱瓊脂CM908（北京陸橋）

準確稱取成品麥康凱瓊脂5.5g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后4℃保存備用。

2.2.6 SS瓊脂HB4089（青島海博）

準確稱取成品SS瓊脂6.35g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后4℃保存備用。

2.2.7 伊紅美藍瓊脂（EMB）02.0.2（北京奧博星）

準確取成品伊紅美藍瓊脂4.25g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸餾水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃時倒制成平板，待凝固后，4℃保存備用。

3 試驗方法

3.1 細菌的培養分離及純化

按照無菌操作，取出樣品，搖勻后用移液器吸取100μl注入普通瓊脂培養基內，再用推棒來回推動，使之在普通瓊脂培養基內分布均勻。待稍干后倒置放入電熱恒溫培養箱中培養18～24h，取出觀察并記錄菌落生長情況。如果細菌太多無法分離時，進行倍比稀釋后再涂布平板分離。對生長的可疑菌落，結合菌落特征、涂片染色鏡檢特征，標記菌株號，并挑取單個菌落進行純化，再涂片，染色鏡檢。若鏡檢無雜菌，再接種于肉湯中，置于37℃恒溫箱培養18～24h，觀察細菌在肉湯中的生長情況，并進行涂片、染色、鏡檢，做好試驗記錄和標記，作為鑒定菌種，同時保存備份菌種，低溫冷藏于冰箱[2]。

3.2 細菌的形態觀察

對各細菌菌落的生長情況和形態結構特征進行觀察記錄，并將純化的細菌進行革蘭氏染色、鏡檢，鏡檢后對尚未純化的細菌從新分離培養及純化。

3.3 細菌的生化鑒定

參照《獸醫微生物實驗指導》[3]《伯杰細菌鑒定手冊》[4]和《常見細菌系統鑒定手冊》[5]中的細菌分群方法，并根據菌落形態特征、革蘭氏染色特征及鏡檢形態等將各分離純化的細菌進行初步確定細菌類屬，確定其生化反應和其他鑒定項目。并將其分別接種于營養瓊脂平板，37℃培養18～24h后供生化試驗用。

3.4 藥敏試驗

參照中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局發布的《動物及其制品中細菌耐藥性的測定-紙片擴散法》中的標準，選擇藥物進行藥物敏感性試驗。

4 試驗結果

4.1 細菌分離純化培養結果

從試驗樣品中分離純化培養共得到38株菌株，沒有發現真菌。將經過純化的38株細菌根據形態、生長特征和生化特性鑒定，分別為：1、12、13、15、16號菌株是表皮葡萄球菌；8、11、18、23、27、37號菌株是木糖葡萄球菌；4、5、10、22、38號菌株是溶血葡萄球菌；35號菌株是腐生葡萄球菌；14號菌株是金黃色葡萄球菌；20、28號菌株是微球菌；17號菌株是黏液奈瑟氏菌；19號菌株是卡他布蘭漢氏菌；36號菌株是金黃奈瑟氏菌；6、29、30、32號菌株是惡臭假單胞菌；24號菌株是類產堿假單胞菌；31、34號菌株是醋酸鈣不動桿菌；2、7、9、33號菌株是黃桿菌（ⅡB群）；21號菌株是缺陷假單胞菌；3號菌株是施氏假單胞菌和25、26號菌株是大腸埃希氏菌。

4.2 藥敏試驗結果

從《動物及其制品中細菌耐藥性的測定-紙片擴散法》中選定藥物對12份試驗樣品中分離鑒定出來的16種細菌進行藥敏試驗，藥物敏感性參照美國臨床和實驗室標準研究所（CLSI）《抗生素敏感性試驗紙片擴散法操作標準》。

藥物敏感性試驗結果表明，葡萄球菌對紅霉素、克林霉素、米諾環素、諾氟沙星、頭孢吡肟高度敏感，對復方新諾明、氨曲南等產生了不同程度的耐藥性；奈瑟氏菌對克拉霉素、頭孢吡肟高度敏感，對復方新諾明、氨曲南產生了不同程度的耐藥性；非發酵菌和腸桿菌科對頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南等有較高的敏感性，對氨芐西林、哌啦西林、氧氟沙星、鏈霉素等產生了不同程度的耐藥性。

5 討論與小結

從分離培養中發現，該奶水牛場患病奶水牛大部分是混合感染，大多數都是由2種或者2種以上的病原菌引起的。這可能與該牛場的飼養環境和飼養管理條件有關。所以在臨床抗菌藥物的使用中，應考慮停用對細菌不敏感的藥物，治療中建議采取聯合用藥方法，不能隨意加大劑量，避免耐藥性產生，從而取得最佳療效。

藥敏試驗結果表明，紅霉素、克林霉素、米諾環素、諾氟沙星、頭孢吡肟等藥物對葡萄球菌屬的菌株敏感或高度敏感；克拉霉素、頭孢吡肟等藥物對奈瑟氏菌屬菌株敏感或高度敏感；頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南等藥物對非發酵菌屬和腸桿菌科的菌株敏感。以上的藥物可作為奶牛子宮內膜炎的首選藥物。

本試驗受設備的限制，沒有進行厭氧菌和真菌的分離培養，但是不能排除尚有厭氧菌和真菌感染的可能。本試驗從患病奶水牛分離到了多種細菌，但這并不一定意味著它們都是子宮內膜炎的直接致病因子。它們中多數為環境中常見菌，有些可能只是繼發性感染。至于具體哪種或哪幾種細菌是子宮內膜炎的直接致病菌，有待進一步研究。

[1]Azawi OI.Postpartum uterine infection in cattle[J].Animal Reproduction Science,2008,105（3）：187-208.

[2]覃慶玉,畢芳芳,張朝勝,楊照海,何寶祥,等.南寧市郊奶牛子宮內膜炎病原菌的分離鑒定[J].廣西畜牧獸醫,2009,25（2）：74-75.

[3]姚火春.獸醫微生物實驗指導（第二版）[M].中國農業出版社,2002,1.

[4][美]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M].科學出版社,1984.

[5]東秀珠,蔡妙英,等.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001,2.