膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用

呂春華舒展漆月黃楊波

（1，新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心 836500；2，廣州悅洋生物技術(shù)有限公司 510300）

膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用

呂春華1舒展1漆月2黃楊波1

（1，新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心 836500；2，廣州悅洋生物技術(shù)有限公司 510300）

膠體金免疫層析技術(shù)自上個(gè)世紀(jì)面世以來(lái)就以其簡(jiǎn)便、特異、敏感、快速無(wú)需設(shè)備和專業(yè)人員的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和臨床診斷等領(lǐng)域，文中介紹該技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)上的發(fā)展進(jìn)程，展現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

膠體金免疫層析技術(shù)；獸醫(yī)；發(fā)展進(jìn)程；應(yīng)用前景；展望；綜述

膠體金免疫層析技術(shù)（Gold-immunochromatography assay，GICA）是在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、單克隆抗體技術(shù)、膠體金技術(shù)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種快速、敏感的免疫檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)在該技術(shù)已成為繼熒光標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)和放射性同位素標(biāo)記技術(shù)之后又一重要的免疫標(biāo)記技術(shù)[1]。本文就將對(duì)GICA技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程、原理及其在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用幾個(gè)方面進(jìn)行介紹。

1 GICA技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程

英國(guó)著名物理學(xué)家、化學(xué)家邁克爾?法拉第在1857年首次制備出膠體金，并發(fā)現(xiàn)膠體金由紅色變?yōu)樗{(lán)色；這一重大發(fā)現(xiàn)，奠定了膠體金制備和應(yīng)用的科學(xué)基礎(chǔ)[2]。繼1962年Feldherr等[3]首次提出將膠體金作為一種用于電子顯微鏡示蹤標(biāo)記物的觀點(diǎn)后，1971年，F(xiàn)aulk等[4]首次將膠體金作為一種新型的有色標(biāo)記物被應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域的研究，建立了一種以膠體金為顯示信號(hào)的免疫標(biāo)記技術(shù)。免疫膠體金技術(shù)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)，并得到了飛速發(fā)展。1974年建立了間接免疫金染色法，1989年建立了斑點(diǎn)金免疫滲濾法，1990年Beggs等在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了簡(jiǎn)易、快速的GICA法[5]。隨著納米技術(shù)的興起和單克隆技術(shù)的成熟，GICA逐漸得到了有效完善和長(zhǎng)足發(fā)展，現(xiàn)在在生物分子識(shí)別等生物醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)診斷和獸醫(yī)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在已有實(shí)力強(qiáng)勁的商品化膠體金診斷試劑盒國(guó)際化生產(chǎn)商，例如專業(yè)生產(chǎn)動(dòng)物診斷檢測(cè)試劑的韓國(guó)安捷（Bionote），生產(chǎn)早孕試紙條的瑞士可麗藍(lán)（Clearblue），生產(chǎn)食品安全檢測(cè)試紙的臺(tái)灣尖端等。

2 GICA技術(shù)原理

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在不同性質(zhì)和濃度的還原劑（如鞣酸、檸檬酸三鈉、白磷、硼氫化鈉和抗壞血酸等）作用下還原而成不同粒徑的膠體金顆粒懸液，又稱金溶膠。GICA技術(shù)的原理是先將已知的抗原或抗體以條帶狀包被到硝酸-纖維素（NC）膜載體上；點(diǎn)樣后，樣品溶液通過(guò)濾膜的毛細(xì)作用向前移動(dòng)；同時(shí)，樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體（抗體或抗原）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測(cè)線），通過(guò)可直接目測(cè)的膠體金顆粒在短時(shí)間內(nèi)聚集而得到可目測(cè)的顯色條帶。GICA和ELISA一樣可以根據(jù)膠體金標(biāo)記物和包被物（捕獲材料）的不同，原理上可以細(xì)分為雙抗夾心法、間接法和競(jìng)爭(zhēng)法等。

3 GICA在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用

3.1 細(xì)菌性病原的檢測(cè)

在獸醫(yī)領(lǐng)域細(xì)菌性疾病很多并且很復(fù)雜，給臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷都帶來(lái)了很多麻煩，所以學(xué)者們也將GICA技術(shù)應(yīng)用到針對(duì)細(xì)菌性病原引起的動(dòng)物疾病檢測(cè)方法的研究中。檢測(cè)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、布魯氏菌和牛分枝桿菌等細(xì)菌的GICA檢測(cè)方法已研制成功[6]，下面筆者將著重介紹布魯氏菌病和牛結(jié)核病兩種疾病的膠體金診斷技術(shù)。

布魯氏菌病（Brucellosis）是一種由布魯氏菌（Brucella）引起的主要侵襲生殖系統(tǒng)的人畜共患傳染病。該病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病之一，我國(guó)也將其列入二類動(dòng)物疫病中。近年來(lái)布魯氏菌病在我國(guó)一些地區(qū)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，特別是現(xiàn)在人民生活對(duì)奶制品需求的提高，促使奶牛和奶制品的貿(mào)易流通量增大，進(jìn)一步擴(kuò)散了疫情。有效控制布病的關(guān)鍵就是快速準(zhǔn)確的對(duì)患病動(dòng)物做出診斷并及時(shí)采取措施，所以國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了布病GICA檢測(cè)技術(shù)的研究，并且已有獸醫(yī)技術(shù)人員在臨床上使用進(jìn)口的商品化試劑盒作為現(xiàn)場(chǎng)診斷布病的依據(jù)。中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和地方的動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所等動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)GICA技術(shù)與ELISA或其他血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了試驗(yàn)對(duì)比，試驗(yàn)結(jié)果顯示GICA有很好的敏感性和特異性，較ELISA和其他血清學(xué)檢測(cè)方法更為快捷簡(jiǎn)便，完全能作為現(xiàn)場(chǎng)診斷布病的有效工具[7-9]。

牛結(jié)核病（Bovine Tuberculosis，bTB）是由牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的一種慢性消耗性傳染病，能感染人和多種動(dòng)物，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)和人類健康。牛結(jié)核病的診斷方法以結(jié)核菌素皮試試驗(yàn)為主，該方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)人力還存在很在檢測(cè)人員的判定誤差和非致病性分枝桿菌的非特異性影響；結(jié)合我國(guó)現(xiàn)在牛結(jié)核病防控的現(xiàn)狀，所以很有必要研制出一種快捷簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確特異的牛結(jié)核病GICA檢測(cè)方法。2007年，張書(shū)環(huán)[10]原核表達(dá)出牛結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原蛋白MPB83和MPB70并分別作為膠體金標(biāo)記抗原和檢測(cè)線捕獲抗原，制備出牛結(jié)核病抗體檢測(cè)試紙條；此試紙條在應(yīng)用中也表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能，與牛結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)符合率為85%，與韓國(guó)進(jìn)口試紙條符合率為98.75%，與結(jié)核菌素皮試試驗(yàn)符合率也高達(dá)80%。GICA技術(shù)運(yùn)用到牛結(jié)核病的常規(guī)監(jiān)測(cè)中，對(duì)我國(guó)人結(jié)核病的防治也具有積極作用。

3.2 病毒性病原的檢測(cè)

在畜牧行業(yè)往往引起動(dòng)物出現(xiàn)疫情的病原很多，其中很大一部分是由病毒性疾病引起的，如引起初生仔豬嚴(yán)重腹瀉死亡的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、引起禽鳥(niǎo)和人感染的禽流感病毒（AIV）、引起犢牛腹瀉的輪狀病毒（RV）等等。如何在眾多病原中做出科學(xué)、精確的診斷不僅需要臨床獸醫(yī)的扎實(shí)技術(shù)和豐富經(jīng)驗(yàn)，還需要我們廣大科研學(xué)者提供更加準(zhǔn)確、便捷的診斷工具，此時(shí)GICA技術(shù)就是一個(gè)有效補(bǔ)充，例如：規(guī)模化豬場(chǎng)在防治仔豬腹瀉中采取初乳管理方案時(shí)，就會(huì)采用PEDV膠體金檢測(cè)卡進(jìn)行病原篩查。

口蹄疫（FMD）被OIE排在A類疫病之首，我國(guó)畜牧業(yè)深受其害，現(xiàn)在有可以鑒別野毒和疫苗抗體的FMD GICA試紙條在市面上流通，為FMD的檢測(cè)防治提供了可靠手段。蔣韜等[11]還建立了O型、A型、Asia1型FMDV定型診斷膠體金免疫層析方法，該方法不與口蹄疫臨床癥狀類似的豬水泡病病毒、水泡性疹病毒、水泡性口炎病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，能檢測(cè)到7.8×104LD50的病毒量，具有良好的特異性和敏感性。

王向鵬等[12]建立了快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)豬瘟病毒（CSFV）野毒的GICA方法，所制備的試紙條用于檢測(cè)CSFV野毒感染的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物，該試紙條不與豬瘟兔化弱毒（HCLV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV-2）、偽狂犬病病毒（PRV）、PEDV和RV反應(yīng)，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，初步達(dá)到了區(qū)分檢測(cè)CSFV野毒株和弱毒株的目的。

李雪松等[13]建立了檢測(cè)PRRSV的具有良好特異性、敏感性、重復(fù)性和實(shí)用性的GICA方法，為我國(guó)藍(lán)耳病的快速診斷和防制提供了技術(shù)手段。Joon T Y等[14]研制了PRV的膠體金試紙條，該試紙條檢測(cè)時(shí)只需25μL樣品，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需5min，并且與常見(jiàn)豬病不發(fā)生交叉反應(yīng)。Kameyama K等[15]建立了快速檢測(cè)BVDV的GICA試紙條，該方法與病毒分離鑒定的敏感性和特異性分別為100%和97.2%。

在禽類疾病方面，Zhang等[16]建立了檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）抗體的GICA法，彭伏虎[17]采取雙抗夾心的方法研制了新城疫病毒（NDV）GICA試紙條。徐一鳴等[18]以膠體金標(biāo)記AIV H3和H7亞型單克隆抗體，以純化的馬抗H3和H7亞型AIV多抗、山羊抗鼠二抗分別包被在檢測(cè)線和質(zhì)控線，制備成試紙條。該試紙條在試驗(yàn)中與血凝和血凝抑制試驗(yàn)、RT-PCR等檢測(cè)方法結(jié)果相符，具有良好的特異性不與其它禽類病原和AIV其它血清亞型發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.3 寄生蟲(chóng)的檢測(cè)

因?yàn)榇蠖鄶?shù)寄生蟲(chóng)病是人獸共患疾病，所以對(duì)畜禽寄生蟲(chóng)病的診斷具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。目前，文獻(xiàn)報(bào)道弓形蟲(chóng)病、隱孢子蟲(chóng)病、日本血吸蟲(chóng)病、鞭蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、片形吸蟲(chóng)病、豬帶絳蟲(chóng)病、奶牛肝片吸蟲(chóng)病、羊東畢吸蟲(chóng)病、犬心絲蟲(chóng)病和犬弓首蛔蟲(chóng)病等疾病的膠體金檢測(cè)試紙條已研制成功并應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。

張少華等[19]以膠體金標(biāo)記豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18重組蛋白抗原，制成了豬帶絳蟲(chóng)GICA診斷試紙條。該試紙條與剖檢計(jì)數(shù)法的相比敏感性為80.0%，與全囊蟲(chóng)抗原ELISA的相比敏感性和特異性分別為75.0%和95.2%。王艷華等[20]研制出敏感性高于IHA，與ELISA相當(dāng)?shù)臋z測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的GICA試紙條，該試紙條能檢出多種動(dòng)物的弓形蟲(chóng)抗體IgG和IgM，具有良好的特異性。秦銀霞等[21]建立的旋毛蟲(chóng)抗體檢測(cè)試紙條，能檢出多種動(dòng)物感染旋毛蟲(chóng)后的陽(yáng)性血清，且不與其他寄生蟲(chóng)病的陽(yáng)性血清產(chǎn)生交互反應(yīng)。

4 展望

GICA技術(shù)從首次報(bào)道以來(lái)，一直成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，通過(guò)幾十年來(lái)不斷的發(fā)展，GICA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中，其檢測(cè)的范圍也在不斷擴(kuò)大，現(xiàn)在GICA技術(shù)已用于檢測(cè)疫病、激素、毒品、藥物、重金屬等方面。獸醫(yī)領(lǐng)域現(xiàn)在使用GICA技術(shù)最多的是寵物醫(yī)院，獸醫(yī)對(duì)于犬瘟病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、犬心絲蟲(chóng)等疾病的臨床診斷主要都是參考商品化膠體金試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。隨著獸醫(yī)檢測(cè)要求的不斷提高，未來(lái)GICA技術(shù)還應(yīng)該向增大檢測(cè)范圍、提高檢測(cè)靈敏度、具有定量或半定量的功能、采用多聯(lián)方式的方向發(fā)展。現(xiàn)階段市面上已有AIV和H7或H9亞型AIV合在一起的檢測(cè)試紙條，即一條試紙上擁有兩條檢測(cè)線；還有能根據(jù)檢測(cè)線條帶顏色深淺參照比色卡比對(duì)，起相對(duì)定量功能的試紙條。相信GICA技術(shù)依靠其快速、靈敏、特異、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和不需要專業(yè)設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的優(yōu)點(diǎn)未來(lái)必將成為獸醫(yī)技術(shù)人員現(xiàn)場(chǎng)診斷的首要參考工具。

[1]Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions[J].Nature Physical Sicence,1973,241(105):15-20.

[2]林彤,獨(dú)軍政,叢國(guó)正,等.膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù)的最新應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(16):8429-8431.

[3]Feldherr C M，Marshall J M.The use of colloidalgold for studies of intracellular exchanges in the ameba chaos[J].J Cell Biol,1962,12(3):640-643.

[4]Faulkw，Taylorn G M.An mimunocolloidal gold method for the electron microscope[J].Immunochemistry,1971,8:1081-1087.

[5]林一民,王云龍,胡永芳,等.膠體金免疫層析技術(shù)在臨床疾病診斷中的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2013(1):91-93.

[6]莊金秋,梅建國(guó),沈志強(qiáng).膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2012(9):70-75.

[7]王楠,姚學(xué)軍,馬立峰,等.布魯氏菌病補(bǔ)體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒敏感性和特異性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)獸藥雜志,2014(1):2-6.

[8]郝璐,戴曉光,申捷,等.幾種布魯氏菌病檢測(cè)方法的比較[J].中國(guó)奶牛,2014(15):23-26.

[9]奚德華,羅堅(jiān)強(qiáng),王姣,等.全乳ELISA、血清ELISA與膠體金試驗(yàn)對(duì)奶牛布魯氏菌病檢測(cè)的比較[J].畜牧與獸醫(yī),2014(12):82-84.

[10]張書(shū)環(huán).牛結(jié)核病膠體金免疫層析方法的建立與初步運(yùn)用[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[11]蔣韜,梁仲,陳涓,等.口蹄疫病毒 O、A、AsiaⅠ型定型診斷膠體金免疫層析方法的建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(11):3801-3808.

[12]王向鵬,孫元,楊增岐.檢測(cè)豬瘟病毒野毒株膠體金免疫層析方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,32(6):441-445.

[13]李雪松,符芳,李海忠,等.快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金免疫層析方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33(9):718-722.

[14]Joon Tam Y，Mohd Lila M，Bahaman A R.Development of solid-based papers trips for rapid diagnosis of pseudorabies infection[J].Trop Biomed,2004,21(2):121-134.

[15]Kameyama K，Sakoda Y，Tamai K，等.Development of an immunochromatographic test kit for rapid detection of bovine viral diarrhea virus antigen[J].Journal of Virological Methods,2006,138(1-2):140-146.

[16]Zhang J，Guo Y，Xiao Y，等.A simple and rapid strip test for detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus[J].J Vet Med Sci,2010,72(7):883-886.

[17]彭伏虎.禽流感與新城疫膠體金免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)及初步應(yīng)用研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[18]徐一鳴,金寧一,楊振國(guó),等.膠體金方法檢測(cè)H3和H7亞型禽流感病毒[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,29(5):580-583.

[19]張少華,駱學(xué)農(nóng),鄭亞?wèn)|,等.豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18重組蛋白快速診斷試紙條研制[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(10):968-972.

[20]王艷華,李克生,才學(xué)鵬,等.弓形蟲(chóng)抗體免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007(1):29-32.

[21]秦銀霞,崔晶,王中全.免疫層析試紙條診斷旋毛蟲(chóng)病的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(9):866-868.

呂春華（1958.2-），男，在職獸醫(yī)碩士，農(nóng)業(yè)推廣研究員，長(zhǎng)期從事動(dòng)物疫病防控及新技術(shù)示范應(yīng)用推廣工作。中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)第一屆、第二屆理事。最近幾年主要從事獸醫(yī)新技術(shù)應(yīng)用推廣工作。主持過(guò)新疆自治區(qū)科技廳成果推廣項(xiàng)目3個(gè)，主持過(guò)阿勒泰地區(qū)科技推廣項(xiàng)目5個(gè)，阿勒泰地區(qū)重大科技項(xiàng)目1個(gè)，撰寫(xiě)制定或參與制定阿勒泰地區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)10余個(gè)。目前主要從事膠體金快速檢測(cè)盒的示范應(yīng)用與推廣工作。