HGF對心肌細胞凋亡保護作用的機制研究

曲環 李美紅 陳琛

HGF對心肌細胞凋亡保護作用的機制研究

曲環 李美紅 陳琛

目的分析肝細胞生長因子(HGF)對于心肌細胞凋亡的保護作用機制。方法分離培養乳鼠心肌細胞, 將培養的乳鼠心肌細胞饑餓處理8 h后, 采用流式細胞儀觀察HGF減少過氧化氫(H2O2)引起的心肌細胞凋亡的保護作用, 計算凋亡細胞百分率；采用蛋白質免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白FOXO3a變化；并觀察使用lipofectamin2000 轉染技術敲除FOXO3a基因后, HGF對H2O2引起心肌細胞凋亡保護作用的變化。結果與對照組相比, 研究組HGF可以顯著減少, H2O2處理引起的心肌細胞凋亡, 檢測顯示心肌細胞內FOXO3a含量基本無變化, 磷酸化的FOXO3a的含量隨時間變化有所增加。而在敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌細胞凋亡的能力顯著減低。結論HGF抑制心肌細胞凋亡損傷,使心肌細胞中的FOXO3a磷酸化增加, 提示HGF促進FOXO3a的磷酸化可能與其對心肌細胞凋亡的保護作用相關。

肝細胞生長因子；心肌細胞凋亡；保護作用

肝細胞生長因子(HGF)具有促血管形成作用, 減少心肌細胞凋亡作用。實驗證明HGF可抑制心肌肥大中心肌細胞的凋亡, 通過抗心肌間質纖維化作用和抑制心肌細胞凋亡作用而抑制左室重構［1］。HGF的作用機制可能是通過MAPK中ERK1/ERK2通路、P38信號轉導通路、PI3K/AKT等調節細胞增殖和凋亡過程。本試驗通過研究HGF對心肌細胞凋亡的保護作用機制, 闡明HGF具體細胞信號作用途徑, 心血管疾病的防治提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 新生乳鼠(北京大學深圳醫院動物中心)；胎牛血清；DMEM培養基；HGF；H2O2；凋亡試劑盒；5-溴脫氧尿嘧啶；一抗；二抗；α-sarcomeric actin。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞分離培養 分步消化、差速貼壁、化學抑制法分離純化新生SD大鼠心肌細胞后代作原代培養；已培養48 h的心肌細胞饑餓處理8 h后, 分為兩組：對照組加入終濃度為0.5 mmol/L的H2O2培養4 h, 研究組加入終濃度為0.5 mmol/L的H2O2和40 ng/ml HGF培養4 h。

1.2.2 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率 根據AnnexinVFITC凋亡檢測試劑盒使用說明, 貼壁的心肌細胞經胰酶消化后, PBS洗滌2次, 收集1×105個細胞, 加入5000 μl L1xBinding buffer重懸細胞, 再加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl Propidium Iodide(PI)充分混勻, 室溫避光孵育15min, 流式細胞儀分別檢測對照組和試驗組心肌細胞凋亡率, 每組各檢測5個樣本。

1.2.3 Western-bolt法觀察細胞信號轉導相關蛋白表達 獲得的各組細胞分別提取總蛋白, 取適量(約20 μg)蛋白,98℃變性5 min,12％SDS-PAGE分離, 電轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。含5％脫脂奶粉緩沖生理鹽水(TBS/T)封閉1 h, 加入一抗(1：1000),4℃過夜, TBS/T洗3次, 加入二抗(1：2000)孵育1 h, TBS/T洗3次, 加入HRP 化學發光底物,壓膠片曝光。

1.2.4 使用lipofectamin2000 轉染 轉染前1 d, 將0.5×105～2×105個細胞接種于培養板中, 每孔中加入約1 ml無抗生素的培養基, 使轉染時的細胞密度能夠達到30％～50％； 取5 μl/孔 Lipofectamine2000,100 μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和后在室溫孵育5 min； 取5 μl FAM-siRNA, 稀釋, 輕輕混和均勻;稀釋的經過5 min 的孵育后,與稀釋FAM-siRNA輕輕混和, 室溫靜置20 min, 形成FAM-siRNA-轉染試劑混和物。將FAM-siRNA-轉染試劑混和液,加入含有細胞及培養液(約含1 ml)的孔中, 輕輕搖晃孔板,使混和；轉染6 h后即可檢測轉染效率：流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 實施t檢驗；計數資料以率(％)表示, 實施 χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

與對照組相比, 研究組HGF可以顯著減少(P＜0.05), H2O2處理引起的心肌細胞凋亡, 檢測顯示心肌細胞內FOXO3a含量基本無變化, 磷酸化的FOXO3a的含量隨時間變化有所增加, 提示HGF的保護作用可能與FOXO3a的磷酸化增加有關。敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌細胞凋亡的能力與顯著減低, 進一步表明HGF抑制心肌細胞凋亡的作用機制可能主要通過PI3K/Akt/FOXO3a途徑, 磷酸化心肌細胞中FOXO3a, 使其活性減低, 從而抑制心肌細胞凋亡發生,而起到對心肌細胞的保護作用。

3 討論

FOX各家族功能多種多樣, 包括各種轉錄因子、參與細胞增殖、轉化及分化過程。作為FOX家族的亞組, FOXO在新陳代謝、細胞增殖、細胞存活及對氧化應激的反應等生物進程中起重要作用。哺乳動物FOXO蛋白質家族有4個成員：FOXO1、FOXO3A 、FOXO4和FOXO6。其中FOXO3A在細胞、組織與胚胎的發育、體內葡萄糖內穩態、卵泡的成熟、細胞增殖、細胞凋亡、對DNA的損傷反應等過程中發揮重要作用。心臟組織以FOXO3A分布為主, 在心肌細胞凋亡中發揮重要作用［2］。活化FOX03A能抑制血管平滑肌增殖, 抑制心肌細胞增生肥大及抗氧化應激等。非磷酸化狀態的FOXO3A為活性轉錄因子, 主要存在心肌細胞核中, FOXO3A磷酸化后與細胞核內的結構蛋白結合, 由細胞核內轉移到核外, FOXO3A喪失轉錄活性, 其抗細胞增殖, 抗心肌肥厚等作用均被抑制［3］。研究發現HGF抑制心肌細胞凋亡損傷, 使心肌細胞中的FOXO3A磷酸化增加, 提示HGF促進FOXO3A的磷酸化可能與其對心肌細胞凋亡的保護作用相關。

［1］劉峰. 高血壓的心臟并發癥. 中國實用內科雜志,2002,22(4):11.

［2］姜勇, 羅深秋. 細胞信號轉導的分子基礎與功能調控. 北京：科學出版社,2005:74.

［3］曹冬梅, 盧建. 叉頭框(Fox)轉錄因子家族的結構與功能 . 生命科學,2006,8(10):16.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.197

2014-12-01］

518036 北京大學深圳醫院心內科(曲環 李美紅),體檢科(陳琛)