丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制及感染性的影響

艾莉莎

丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制及感染性的影響

艾莉莎

目的分析丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制及感染性的影響。方法利用生物化學試驗法進行分析, 首先對丙型肝炎病毒RNA的轉錄體進行制備, 然后根據培養、轉染、PCR技術、免疫熒光檢測以及復制感染性檢測等技術進行相關試驗, 對試驗結果進行記錄。結果經過試驗后得出結果, 利用J6JFH1/△F轉染的病毒單邊反應明顯減少, 對上清液毒滴度檢測明顯下降。同時F蛋白缺失型丙型肝炎病毒中翻譯毒蛋白的RNA含量也有所降低, 病毒顆粒的產生顯著下降。但F蛋白缺失型丙型肝炎病毒的核心蛋白二級結構基本沒有發生變化。結論F蛋白的缺失對于病毒本身的復制和感染性并沒有影響, 但也并不確定F蛋白是HCV的副產物。

丙型肝炎病毒；F蛋白；影響

丙型肝炎病毒是導致人體患上丙型肝炎的罪魁禍首, 其屬于黃病毒科, 是在外部具有包膜的單正鏈RNA病毒。早在1974年就已經有相關研究人員發現了這種病毒, 并在1989年時確定了該病毒的基因序列, 并成功克隆出丙肝病毒, 并將因其所引發的疾病正式命名為丙型肝炎。根據相關研究報告顯示, 每年約有10萬人感染丙型肝炎, 并由此引發脂肪肝、肝硬化以及肝癌等疾病。目前, 全球約有1.7億人被丙型肝炎所折磨。相關研究者在對其進行研究中發現了其核心蛋白之一——F蛋白, 并對其進行了十余年的研究, 但對該蛋白的主要功能還沒有系統了解［1］。因此, 作者對F蛋白缺失對丙型肝炎病毒的復制和感染能力的影響進行了相關試驗, 以期能為相關工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 異丙基硫代半乳糖甘、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-1-半乳糖苷、NZ胺、酵母提取物、14 mlBD Falcon聚丙烯管、丙型肝炎病毒單克隆抗體9E10、M-MLV反轉錄酶、T7體外轉錄試劑盒、胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、Alex488羊抗鼠熒光二抗、FITC-羊抗人IgG、RNA抽提試劑、RotorGene3000熒光定量PCR儀、電穿孔儀、PMD18T等。

1.2 方法 在開始試驗前, 第一步需要做的是對質粒的構建和細胞株的培養, 將J6JFH1/△F利用定點突變試劑盒引入5處突變, 分別是nt406T-A、nt433T-A、nt472G-A、nt479G-A(或nt481G-A)以及nt613C-A。第二步是對丙型肝炎病毒RNA轉錄體的制備工作。首先是準備7種質粒, 分別是對比質粒、原丙型肝炎病毒質粒以及5種突變后的丙型肝炎病毒質粒, 對其進行XbaⅠ線性化處理；然后利用T7體外轉錄試劑盒對各質粒的RNA進行體外轉錄；再利用飽和苯酚-氯仿-異戊醇溶液對RNA進行純化處理。第三步是對實驗細胞的培養。將健康細胞在配置好的培養液中進行培養, 將細胞在37℃的溫度下進行培養, 培養環境中二氧化碳的濃度應保持在5％左右。培養液中含有10％的胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、NEAA0.1 mmol/L、鏈霉素100 g/ml以及青霉素100 U/ml。第四步是對RNA轉錄體的轉染工作。首先取1000 g胰蛋白酶細胞, 在離心5 min后, 取下層液體, 利用DEPC_PBS進行清洗；二次離心5 min, 取下層液體, 利用Opti-MEM進行清洗；三次離心5 min, 去下層液體, 再次利用Opti-MEM進行重懸, 并對溶液中的細胞進行技術。然后將溶液稀釋到1×107個/ml, 并取出400 μl轉移到電擊杯中(電擊杯的規格為4 mm)。第五步是將病毒RNA的轉錄體轉移到電擊杯中, 搖勻, 將電穿孔儀調整到270V、960 μl、100 Ωm, 僅對電擊杯進行一次點擊, 之后迅速將溶液轉移到平皿中, 并在平皿中加入10％的胎牛血清培養液, 在一定條件下進行培養(培養條件與細胞培養條件相同)。第六步是在轉染3 d后對培養液中的丙型肝炎病毒RNA進行定量, 隨機選擇引物將RNA逆轉錄為cDNA, 然后利用雙標準曲線法進行定量檢測。第七步是進行免疫熒光測試。將已經轉染過的培養細胞接種到培養板上(規格為96孔), 然后再放于一定條件環境下進行培養(條件與細胞培養條件相同), 在培養2 d后取出, 取下層液體, 在每個孔內加入100 μl的甲醇溶液,并在零下20℃ 環境下固定20 min, 之后用PBS進行清洗, 分三次共5 min完成；再次在小孔中加入Triton100溶液(濃度為0.1％, 劑量為100 μl), 在室溫下進行透化, 時間為半小時,之后用PBS進行清洗, 方法同上；然后再加入BSA溶液(濃度為3％, 劑量為100 μl), 在室溫下進行1 h的封存；最后將封存液丟棄, 在小孔內加入相關試劑培養, 并利用顯微鏡進行拍照。第八步是對轉染細胞上清液進行病毒滴度測試［2,3］。

2 結果

經過試驗后得出結果, 利用J6JFH1/△F轉染的病毒單邊反應明顯減少, 對上清液毒滴度檢測明顯下降。同時F蛋白缺失型丙型肝炎病毒中翻譯毒蛋白的RNA含量也有所降低,病毒顆粒的產生顯著下降。但F蛋白缺失型丙型肝炎病毒的核心蛋白二級結構基本沒有發生變化。

3 小結

經過試驗顯示, F蛋白對于病毒的復制性和感染性的影響力較低, 其本身對于丙型肝炎病毒的作用不大。同時, 對F蛋白是否能夠行使C蛋白的功能也存在一定的異議, F蛋白對于宿主免疫系統的危害能力有待進一步的研究。

［1］Boumlic A, Vassilaki N, Dalagiorgou G, et al. Internal translation initiation stimulates expression of the ARF/core+1 open reading frame of HCV genotype1b. Virus Res,2011,155(1):213-124.

［2］Yuksek K, Chen WL, Chien D, et al. Ubiquitin-independent degradation of hepatitis C virus F protein. J Virol,2009,83(2):612-613.

［3］王文博, 許剛, 王巖, 等. 丙型肝炎病毒F蛋白缺失對病毒復制及感染性的影響.生物化學與生物物理進展,2012,39(2):142-143.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.198

2014-12-03］

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