從隔山消中制備4種苯乙酮對照品*

張錦，胡露，李月婷，劉俊宏，陳思穎，張桂青，李勇軍

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽550004；2.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004；3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

從隔山消中制備4種苯乙酮對照品*

張錦1，2，胡露1，3，李月婷1，2，劉俊宏1，3，陳思穎1，2，張桂青1，2，李勇軍1，3

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽550004；2.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004；3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

目的建立從隔山消中分離制備4種苯乙酮對照品的方法。方法采用溶劑提取，應(yīng)用色譜技術(shù)分離純化，根據(jù)化合物理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu)，用薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行純度檢查。結(jié)果制備得到的對照品經(jīng)薄層色譜檢查無雜質(zhì)，純度均在98%以上，符合中藥化學(xué)對照品含量測定要求。結(jié)論制備所得的對照品可用于隔山消及其制劑的質(zhì)量控制。

隔山消；苯乙酮；對照品

1　儀器與材料

超高效液相色譜儀（Acquity UPLC），質(zhì)譜儀（Acquity-TQD），核磁共振波譜儀（JEOL-ECX-500）；柱層析用硅膠及硅膠G預(yù)制板（青島海洋化工廠），Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia Biotech公司），MCI75-150μm（日本三菱化學(xué)公司），D101大孔樹脂（青島海洋化工廠）。試劑均為分析純，水為蒸餾水。隔山消藥材由貴州飛云嶺藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院王世清教授鑒定為蘿科植物耳葉牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight的干燥塊根。

2　方法與結(jié)果

2.1提取與分離

取隔山消藥材粗粉15 kg，用70%乙醇回流提取3次，合并提取液，回收溶劑得稠膏，稠膏用水溶解成每1mL含1 g生藥的溶液，靜置，取上清液上于D101大孔樹脂，依次用水、60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫部分，減壓回收溶劑至稠膏，取稠膏經(jīng)硅膠柱層析以氯仿-甲醇（10∶0→7∶3，加少量醋酸）進(jìn)行梯度洗脫，分段收集，各段進(jìn)行薄層色譜（TLC）法檢測并合并，得到7個部分。其中Fr.2經(jīng)反復(fù)LH-20、硅膠柱層析得到化合物1（500 mg）、化合物2（200mg）、化合物3（300mg），F(xiàn)r.3經(jīng)反復(fù)的硅膠柱層析得到化合物4（9 g）。

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針晶（甲醇），紫外燈254 nm下有暗斑，碘反應(yīng)陽性。ESI-MS（m/z）：136.6［M+H］+，134.6［M-H］-；1HNMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.86（2H，d，J=8.55 Hz，H-2，6），6.82（2H，d，J=9.15 Hz，H-3，5），2.49（3H，s，COCH3）；13CNMR（125 MHz，CD3OD）δ：198.2（C=O），162.6（C-4），130.8（C-2，6），128.6（C-1），114.9（C-3，5），25.0（-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)與文獻(xiàn)［7］報道的4-羥基苯乙酮（4-hydroxyacetophenone）數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為4-羥基苯乙酮。

化合物2：黃綠色粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，碘反應(yīng)陽性。ESI-MS（m/z）：151.3［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：7.55（1H，d，J=2.9 Hz，H-6），7.37（1H，dd，J=8.8 Hz，2.9 Hz，H-4），7.10（1H，d，J=8.8 Hz，H-3），2.49（3H，s，COCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)與文獻(xiàn)［8］報道的2，5-二羥基苯乙酮（2，5-dihydroxyacetophenone）數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為2，5-二羥基苯乙酮。

化合物3：米白色粉末，紫外燈254 nm下有暗斑，碘反應(yīng)陽性。ESI-MS（m/z）：153.1［M+H］+，151.2［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.71（1H，d，J=9.0 Hz，H-6），6.35（1H，dd，J=9.0 Hz，2.3Hz，H-5），6.23（1H，d，J=2.3 Hz，H-3），2.51（3H，s，COCH3）；13C-NMR（100MHz，CD3OD）δ：204.3（C=O），166.5（C-2），166.3（C-4），134.5（C-6），114.4（C-1），109.1（C-5），103.5（C-3），25.0（-CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)與文獻(xiàn)［9］報道的2，4-二羥基苯乙酮（2，4-dihydroxyacetophenone）數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為2，4-二羥基苯乙酮。

化合物4：淡黃色晶體（氯仿-甲醇），紫外燈254 nm下有暗斑，氯化鐵溶液顯紅棕色，碘反應(yīng)陽性。ESI-MS m/z：303.2［M+H］+，301.4［M-H］-，603.4［2M-H］-；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6）δ：2.21（3H，s，phenyl-CH3），2.54（3H，s，COCH3），6.44（1H，d，J=9.2 Hz，H-5），6.69（1H，d，J=9.2 Hz，H-3′），6.75（1H，d，J=9.2 Hz，H-4′），7.70（1H，d，J=9.2 Hz，H-4），8.51（1H，s，C5′-OH），9.31（1H，s，C6-OH），10.31（1H，s，C2′-OH），12.88（1H，s，C2-OH）；13C-NMR（125MHz，DMSO-d6）δ：203.2（C-7），203.1（C-8），162.5（C-2），162.3（C-6），148.0（C-5′），146.9（C-2′），132.2（C-4），130.2（C-6′），118.1（C-4′），117.4（C-3′），115.8（C-1′），112.3（C-3），111.5（C-1），107.5（C-5），30.7（C-10），26.2（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道的白首烏二苯酮（baishouwubenzophenone）數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為白首烏二苯酮。

2.3純度考察

2.3.1TLC法

4-羥基苯乙酮：將4-羥基苯乙酮樣品用甲醇制成每1 g/L的溶液，分別點樣2，5，10，15，20μL于硅膠GF254板上，分別以甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸（7∶3∶0.05）、氯仿-丙酮-冰乙酸（9.5∶0.5∶0.05）、氯仿-乙酸乙酯-冰乙酸（8∶2∶0.05）為展開劑。紫外光燈254 nm波長下檢視后用碘顯色，在日光下檢視。結(jié)果表明，在3種展開劑和2種檢視方式下，樣品均為1個斑點，未見其他雜質(zhì)斑點。

2，5-二羥基苯乙酮：將2，5-二羥基苯乙酮樣品用甲醇制成1 g/L的溶液，分別點樣2，5，10，15，20μL于硅膠GF254板上，分別以甲苯-乙酸乙酯（8∶2）、氯仿-乙酸乙酯（9∶1）、石油醚-乙酸乙酯（7∶3）為展開劑。紫外光燈254 nm波長下檢視后用碘顯色，在日光下檢視。結(jié)果表明，在3種展開劑和2種檢視方式下，樣品均為1個斑點，未見其他雜質(zhì)斑點。

2，4-二羥基苯乙酮：將2，4-二羥基苯乙酮樣品用甲醇制成1 g/L的溶液，分別點樣2，5，10，15，20μL于硅膠GF254板上，分別以甲苯-乙酸乙酯（8∶2）、氯仿-乙酸乙酯（9∶1）、石油醚-乙酸乙酯（7∶3）為展開劑。紫外光燈254 nm波長下檢視后用碘顯色，在日光下檢視。結(jié)果表明，在3種展開劑和2種檢視方式下，樣品均為1個斑點，未見其他雜質(zhì)斑點。

白首烏二苯酮：將白首烏二苯酮樣品用甲醇制成1 g/L的溶液，分別點樣2，5，10，15，20μL于硅膠GF254板上，分別以氯仿-甲醇（9.2∶0.8）、氯仿-乙酸乙酯-甲醇（7∶3∶0.5）、氯仿-丙酮（7∶3）為展開劑。紫外光燈254 nm波長下檢視后用碘顯色，在日光下檢視。結(jié)果表明，在3種展開劑和2種檢視方式，下樣品均為1個斑點，未見其他雜質(zhì)斑點。2.3.2高效液相色譜（HPLC）法

4-羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮、2，4-二羥基苯乙酮：稱取3種樣品適量，分別用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液。色譜柱為AgilentEclipsePlusC18RRHD柱（100mm×2.1mm，1.8μm），流動相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序為0min（5∶95）～10min（100∶0），流速為0.3mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為205，220，254，280，310nm，進(jìn)樣量為3μL。結(jié)果表明，在5個波長下所得HPLC圖譜中顯示1個主峰，采集時間為主峰保留時間的2倍以上。質(zhì)量分?jǐn)?shù)以峰面積歸一化法計算均大于98%。

白首烏二苯酮：稱取白首烏二苯酮適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g/L的對照品溶液。色譜柱為Diamonsil C18柱（250mm× 4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫程序為0 min（15∶85）～40 min（80∶20），流速為1 mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為205，220，254，280，310 nm，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果表明，在5個波長下所得HPLC圖譜中顯示1個主峰，采集時間為主峰保留時間的2倍以上。質(zhì)量分?jǐn)?shù)以峰面積歸一化法計算均大于98%。

3　討論

由于隔山消的主要成分C21甾體苷類多為去氧糖甲醚的糖苷，經(jīng)試驗研究，該類成分無法經(jīng)水煎煮提取出來。為尋找隔山消藥材水溶性部位質(zhì)量控制指標(biāo)成分，筆者對隔山消水溶性部位化學(xué)成分進(jìn)行研究，對其中含量較高的4個化合物進(jìn)行制備，結(jié)果表明，分離制備得到的4個化合物純度均大于98%，并進(jìn)行高溫、高濕和強光照射試驗，4個對照品理化性質(zhì)均較穩(wěn)定，達(dá)到了中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用化學(xué)對照品的要求，故可作為隔山消及其制劑的質(zhì)量控制用對照品。

［1］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M］.貴陽：貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2003：384.

［2］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.《中華本草-苗藥卷》［M］.貴陽：貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2005：528.

［3］彭蘊茹，丁永芳，李友賓，等.白首烏研究現(xiàn)狀［J］.中草藥，2013，44（3）：370-378.

［4］陳艷，徐必學(xué)，梁光義，等.隔山消化學(xué)成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20（6）：1 012-1 013.

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Preparation of 4

ubstances of Acetophenone from Cynanchum Auriculatun

Zhang Jin1，2，Hu Lu1，3，Li Yueting1，2，Liu Junhong1，3，Chen Siying1，2，Zhang Guiqing1，2，Li Yongjun1，3
（1.School of Pharmacy，Guiyang Medical College，Guiyang，Guizhou，China 550004；2.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，Guiyang，
Guizhou，China 550004；3.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education，
Guiyang，Guizhou，China 550004）

Objective To establish a method for the isolation and preparation of 4 reference substances of acetophenone from Cynanchum auriculatun.M ethods Chromatographic techniques were employed for isolation and purification of the constituents and their structures were determined by spectral analysis and chemical evidence.The purity was analyzed by TLC and HPLC.Results The purity levels of these compounds were all over 98%，which was in auordance with thd content determination requirement of the TCM chemical reference substance.Conclusion These compounds can be used as a reference substance in the quality control and the preparations of Cynanchum auriculatun.

Cynanchum auriculatun；acetophenone；reference substance

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）16-0012-02

張錦（1991-），女，碩士研究生，主要從事中藥、民族藥的質(zhì)量控制研究工作，（電子信箱）1208552141@qq.com；李勇軍（1973-），男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事天然藥物化學(xué)、中藥新藥制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，本文通訊作者，（電子信箱）liyongjun026@126.com。

2015-02-05）

*國家科技支撐計劃項目，項目編號：2013BAI11B01；貴州省科技廳資助項目，項目編號：［2013］4001，［2013］5062。