PTEN啟動子甲基化及基因表達與宮頸癌臨床指標的關聯研究

郝爍月

(遼寧省遼陽市中心醫院婦產科，遼寧 遼陽 111000)

PTEN啟動子甲基化及基因表達與宮頸癌臨床指標的關聯研究

郝爍月

(遼寧省遼陽市中心醫院婦產科，遼寧 遼陽 111000)

目的 探討PTEN啟動子甲基化及基因表達與宮頸癌臨床指標的相關性。方法 選取2013年1月至2014年1月期間遼陽市中心醫院收治的100例宮頸癌患者作為研究對象，分別采用PCR-SSCP、甲基化特異性PCR及免疫組化技術檢測組織PTEN啟動子甲基化及基因表達情況，并分析其與患者臨床病理資料的相關性，PTEN啟動子甲基化及基因表達相關性。結果 100例宮頸癌患者中PTEN啟動子甲基化陽性例數為62例，PTEN啟動子甲基化率為62.0%。PTEN基因表達陽性例數50例，陽性率為50.0%。PCR-SSCP分析發現1例患者出現新的突變，位于第9個外顯子。PTEN啟動子甲基化與宮頸癌患者FIGO分期、腫瘤分級、腫瘤大小以及淋巴結轉移均有顯著相關性(χ2值分別為4.802、8.440、7.472、8.237，均P<0.05)，與宮頸癌患者年齡以及組織分型均無顯著相關性(χ2值分別為0.075、0.180，均P>0.05)。PTEN基因表達與宮頸癌患者FIGO分期以及淋巴結轉移有顯著相關性(χ2值分別為2.597、7.250，均P<0.05)，與宮頸癌患者年齡、腫瘤分級、腫瘤大小以及組織分型均無顯著相關性(χ2值分別為0.041、2.627、2.716、0.219，均P>0.05)。宮頸癌組織中PTEN啟動子甲基化及其基因表達呈顯著負相關(r=-0.65，P=0.014)。結論 PTEN啟動子甲基化可以抑制PTEN基因的轉錄，降低其蛋白表達，PTEN蛋白表達降低可能參與宮頸癌發生、浸潤和轉移。

PTEN基因；啟動子甲基化；基因表達；宮頸癌

PTEN基因位于人第10號染色體，是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼產物PTEN蛋白具有調節細胞生長周期、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長及侵襲轉移等作用。相關研究發現PTEN在多種腫瘤組織中表達下調，但其發生機制尚不完全清楚[1]。為了探討PTEN啟動子甲基化及基因表達對宮頸癌患者的影響，本文對遼陽市中心醫院2013年1月至2014年1月期間收治的100例宮頸癌患者進行研究，現將內容報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2014年1月期間遼寧省遼陽市中心醫院婦產科收治的100例行手術切除的宮頸癌患者作為研究對象，所有患者經病理學診斷確診為宮頸癌，均未接受輔助放化療。年齡范圍38～78歲，平均年齡60.3±8.3歲。本研究經本院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。腫瘤的組織學類型和分類參照世界衛生組織制定的腫瘤進行分類標準，腫瘤組織的臨床分期參照國際婦產科聯合會(international federation of gynecology and obstetrics，FIGO)制定的標準[2]。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌組織DNA提取

將制作好腫瘤組織石蠟塊切成10μm大小，并于液氮的條件下研磨粉碎，取0.1g粉碎的組織懸浮于1mL 0.25%的二甲苯溶液中，55℃條件下靜置15min，取懸浮液離心5min，取沉淀懸浮于0.1mL二甲苯溶液中，重復上述步驟，棄去上清。使用100%乙醇和二甲苯裂解緩沖液溶解沉淀，并加入濃度為300μg/mL的蛋白酶K裂解液，充分混勻后55℃過夜，采用酚-氯仿法提取DNA，并溶于TE緩沖液，儲存于-20℃條件下保存備用。

1.2.2 PTEN啟動子甲基化分析

分別設計PTEN啟動子區9個外顯子的引物，采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性(polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)技術和甲基化特異性PCR(methylation-specific polymerase chain reaction MS-PCR)檢測技術檢測，以試劑盒提供的通用甲基化DNA標準作為陽性對照，水和未修飾的DNA用作反應陰性對照，重復PCR已確認結果。PTEN啟動子未甲基化引物：5'-TTTTTTGGGTTTTTGAAATTTAATG-3'，5'-AACCTACTATTATA￣TCACCAACATA-3'PTEN啟動子甲基化引物：5'-GTTTTTT￣GGGTTTTTGAAATTTAAC-3'，5'-AACCTACTATTAT￣ATCGCCA￣ACGTA-3'。

1.2.3 PTEN基因表達檢測

采用免疫組化技術檢測PTEN基因表達情況，免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，嚴格按照說明及免疫組化操作步驟操作。PTEN陽性標本的宮頸炎患者的切片作為陽性對照，無第1抗體的切片作為陰性對照。染色結果判定為陰性或者陽性，腫瘤細胞≥10%呈陽性免疫反應性的切片判定為陽性，腫瘤細胞<10%呈陽性免疫反應性的切片判定為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析。宮頸癌患者病理資料與PTEN啟動子甲基化以及基因表達等相關性的計數資料率的比較采用χ2檢驗。采用經非參數Spearman等級相關分析PTEN啟動子甲基化及其基因表達相關性，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者PTEN啟動子外顯子甲基化、基因表達及突變情況分析

在100例宮頸癌患者中，PTEN啟動子甲基化陽性例數為62例，PTEN啟動子甲基化率為62.0%。PTEN基因表達陽性例數50例，陽性率為50.0%。PCR-SSCP分析發現1例患者出現新的突變，位于第9個外顯子。

2.2 宮頸癌患者病理資料與PTEN啟動子甲基化相關分析

PTEN啟動子甲基化與宮頸癌患者FIGO分期、腫瘤分級、腫瘤大小以及淋巴結轉移均有顯著相關性(χ2值分別為4.802、8.440、7.472、8.237，均P<0.05)，與宮頸癌患者年齡以及組織分型均無顯著相關性(χ2值分別為0.075、0.180，均P>0.05)，見表1。

2.3 宮頸癌患者病理資料與PTEN基因表達相關分析

PTEN基因表達與宮頸癌患者FIGO分期以及淋巴結轉移均有顯著相關性(χ2值分別為2.597、7.250，均P<0.05)，與宮頸癌患者年齡、腫瘤分級、腫瘤大小以及組織分型均無顯著相關性(χ2值分別為0.041、2.627、2.716、0.219，均P>0.05)，見表2。

表1 宮頸癌患者病理資料與PTEN啟動子甲基化相關分析(n)

表2 宮頸癌患者病理資料與PTEN基因表達相關分析(n)

2.4 宮頸癌患者PTEN啟動子甲基化及其基因表達相關性

經非參數Spearman等級相關分析，在宮頸癌組織中PTEN啟動子甲基化及其基因表達呈顯著負相關(r=-0.65，P=0.014)，見表3。

表3 宮頸癌患者PTEN啟動子甲基化及其基因表達相關性(n)

3 討論

3.1 PTEN基因表達與腫瘤的發生

宮頸癌是第2大常見女性惡性腫瘤，每年約有78萬女性患者死于宮頸癌，其發生發展過程與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關。已經發現PTEN基因表達在癌癥細胞系以及腦、胃原發性腫瘤、乳腺癌和腎癌等腫瘤組織缺失。在胃癌，非小細胞肺癌和子宮頸癌中發現PTEN基因啟動子出現甲基化現象[3-4]，而在腫瘤組織中PTEN啟動子突變、甲基化和基因的表達相關性尚未有相關報道。

3.2 宮頸癌中PTEN突變

研究表明PTEN突變和缺失在相關癌組織中較為普遍，在子宮內膜癌發生率約為40%，在膠質母細胞瘤發生率約為25%，在卵巢癌發生率約為21%，在前列腺癌發生率約為13%[5]。但是在宮頸癌組織中的突變率似乎較低。本研究結果發現，100例宮頸癌患者僅有1例患者出現突變，而在外國人群中調查數據顯示宮頸癌組織中的PTEN突變率約為2%。

3.3 PTEN啟動子甲基化及其基因表達與宮頸癌病理因素相關性

本研究結果顯示，PTEN啟動子甲基化與宮頸癌患者FIGO分期、腫瘤分級、腫瘤大小以及淋巴結轉移有相關性(P<0.05)，且PTEN基因表達與宮頸癌患者FIGO分期以及淋巴結轉移有相關性(P<0.05)，表明PTEN在宮頸癌發生、發展、浸潤和轉移過程中發生重要作用，而PTEN啟動子甲基化及其基因表達缺失不利于宮頸癌患者的預后。有研究報道，PTEN缺失常發生在宮頸癌早期，與盆腔淋巴結轉移密切相關[6]。本研究經非參數Spearman等級相關分析，在宮頸癌組織中PTEN啟動子甲基化及其基因表達呈負相關(P=0.014)，提示PTEN的表達降低，可能是由于PTEN基因的啟動子甲基化所致，PTEN基因啟動子甲基化是一種重要的基因沉默機制。而相關研究也認為DNA甲基化能夠抑制轉錄和微小RNA介導的mRNA降解，導致翻譯終止，從而導致PTEN表達減少[7]。

綜上所述，PTEN啟動子甲基化可以抑制PTEN基因的轉錄，降低其蛋白表達，PTEN蛋白表達降低可能參與宮頸癌發生、浸潤和轉移，PTEN的表達可能是宮頸癌預后的一個好的標志。

[1]Xie Q, Bai Q, Zou L Y,etal. Genistein inhibits DNA methylation and increases expression of tumor suppressor genes in human breast cancer cells[J].Genes Chromosomes Cancer，2014,53(5):422-431.

[2]楊晨曦,王寧,張婷,等.宮頸癌細胞系及宮頸組織PTEN基因啟動子區甲基化狀態的檢測與分析[J].現代婦產科進展,2014,23(2):89-93.

[3]Woelber L,Kress K, Kersten J F,etal.Carbonic anhydrase IX in tumor tissue and sera of patients with primary cervical cancer[J].BMC Cancer.2011,11:12.

[4]Rizvi M M,Alam M S,Ali A,etal.Aberrant promoter methylation and inactivation of PTEN gene in cervical carcinoma from Indian population[J].J Cancer Res Clin Oncol,2011,137(8):1255-1262.

[5]Stiles B L.Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10:Extending its PTEN tacles[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(4):757-761.

[6]Eijsink J J,Noordhuis M G, ten Hoor K A,etal.The epidermal growth factor receptor pathway in relation to pelvic lymph node metastasis and survival in early-stage cervical cancer[J].Hum Pathol，2010,41(12):1735-1741.

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[專業責任編輯：安瑞芳]

Correlation of PTEN promoter methylation and gene expression with clinical indicators in cervical cancer

HAO Shuo-yue

(DepartmentofObstetricsandGynecology,CenterHospitalofLiaoyangCity,LiaoningLiaoyang111000,China)

Objective To investigate the correlation of PTEN promoter methylation and gene expression with clinical indicators in cervical cancer. Methods From January 2013 to January 2014 totally 100 cases of cervical cancer admitted in Center Hospital of Liaoyang City were recruited in the study. Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), methylation-specific polymerase chain reaction (MS-PCR) and immunohistochemical method were used to detect PTEN promoter methylation and gene expression, analyze their correlation with clinical pathological information as well as the correlation between PTEN promoter methylation and gene expression. Results The rate of PTEN promoter methylation of 100 cases was 62.0%, and the positive rate of PTEN gene expression was 50.0%. PCR-SSCP analysis found that one patient had a new mutation located on the ninth exons. PTEN promoter methylation were significantly correlated with FIGO stage, tumor grade, tumor size and lymph node metastasis (χ2value was 4.802, 8.440, 7.472 and 8.237, respectively, allP<0.05), but not significantly correlated with age and tissue typing (χ2value was 0.075 and 0.180, respectively, bothP>0.05). PTEN gene expression were significantly correlated with FIGO stage and lymph node metastasis (χ2value was 2.597 and 7.250, respectively, bothP<0.05), but not significantly correlated with age, tumor grade, tumor size and tissue typing (χ2value was 0.041, 2.627, 2.716 and 0.219, respectively, allP>0.05). PTEN promoter methylation in cancer tissue was negatively correlated with gene expression (r=-0.65,P=0.014). Conclusion PTEN promoter methylation can inhibit transcription of PTEN and reduce its protein. PTEN protein expression decreasing may induce the occurrence, invasion and metastasis of cervical cancer.

PTEN; promoter methylation; gene expression; cervical cancer

2014-11-18

郝爍月(1975-)，女，副主任醫師，碩士，主要從事婦產科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.041

R711.7

A

1673-5293(2015)01-0105-03